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>1. Neuronale Differenzierung
HINWEIS: Führen Sie die Schritte 1.1 - 1.5 vor Mittag und Schritt 1.7 nach Mittag durch. Eine Übersicht über die Differenzierungsverfahren ist in Abbildung 1A dargestellt.
- 350 μl (3,5 x 106) Es-Zellen in eine 10 cm große Schale mit niedrigem Aufsatz mit 25 ml Differenzierungsmedium überführen. Auf einen auf 30 - 45 U/min eingestellten Orbitalschüttler in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 stellen. Dies ist der erste Tag der Differenzierung, der als Day in vitro (DIV) -8.
bezeichnet wird.
Anmerkung: Die Verwendung einer Schale mit extrem niedrigem Aufsatz erhöht die Kosten der Methode, führt jedoch zu etwas höheren Erträgen als bei bakteriellen Petrischale, da Aggregate gelegentlich an Petrischalen haften können. Werden unterschiedliche Schalengrößen bevorzugt, können mittlere Volumina und Zellzahlen entsprechend skaliert werden.
- Nach 48 Stunden (DIV -6) werden die differenzierenden Zellaggregate mit einer 25-ml-Pipette in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführt. Geben Sie sofort frische 25 ml Differenzierungsmedium in die Petrischale.
- Lassen Sie die Zuschlagstoffe über 2 - 5 Minuten absetzen, wodurch ein sichtbares Pellet entsteht, das 1 - 2 mm tief ist. Ignorieren Sie einzelne Zellen oder kleine Aggregate, die in Suspension verbleiben. Saugen Sie das Medium vorsichtig an und übertragen Sie das Zellpellet mit einem P1000 zurück in die Petrischale. Auf einen Rotationsschüttler in einen Gewebekultur-Inkubator stellen.
- Bei DIV -4 wiederholen Sie Schritt 1.2. Das Pellet wird 2 - 4 mm tief sein. 30 ml Differenzierungsmedium, das mit 6 μM all-trans-Retinsäure (RA) zugesetzt ist, werden in die Petrischale gegeben. Kehren Sie für weitere 48 Stunden in den Rotationsschüttler in den Gewebekultur-Inkubator zurück.
- Wiederholen Sie bei DIV -2 Schritt 1.3. Das Pellet ist zu diesem Zeitpunkt 4 - 8 mm tief.
- Bereiten Sie bei DIV -1 die Beschichtungsoberflächen wie in Abschnitt 2 vor.
- Bei DIV 0 5 ml präaliquotiertes und gefrorenes NPC-Trypsinisierungsmedium bei 37 °C 5 - 10 min auftauen und in eine Gewebekulturhaube geben. Mit einer 25-ml-Pipette die differenzierenden Aggregate in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführen. Lassen Sie die Zuschlagstoffe absetzen und saugen Sie das Medium vorsichtig an. Waschen Sie das Pellet zweimal mit 10 ml PBS, damit sich die Zuschlagstoffe zwischen den Wäschen absetzen können.
- Nach der zweiten PBS-Wäsche 5 ml NPC-Trypsinisierungsmedium zum Pellet geben und 5 min bei 37 °C inkubieren. Nach 2,5 min vorsichtig auf das Röhrchen schnippen.
- Fügen Sie 5 ml 0,1% Soja-Trypsin-Hemmer (STI) hinzu, um Trypsin zu inaktivieren, und mischen Sie durch Invertieren. 10 - 15 Mal mit einer 10 ml serologischen Pipette vorsichtig zermalen, bis eine relativ homogene Zellsuspension entsteht.
- Übertragen Sie die Zellsuspension langsam in ein 40 μm oder 70 μm Zellsieb, das auf einem konischen 50-ml-Röhrchen platziert ist. Sobald die gesamte Suspension filtriert wurde, fügen Sie 1 ml N2-Medium hinzu, um die verbleibenden Zellen durch den Filter zu waschen, und pelletieren Sie die dissoziierte Zellsuspension 6 Minuten lang bei 200 x g.
- Saugen Sie das Medium an, ohne das Pellet zu stören. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 ml N2-Medium, pelletieren Sie die Zellen für 5 min bei 200 x g und verreiben Sie sie zwischen den Waschgängen mit einem P1000. Zählen Sie die Zellen vor dem zweiten Waschen mit einem Hämozytometer.
- Resuspendieren Sie Zellen in N2-Medium bei 1 x 107 Zellen pro ml und plattieren Sie ESNs mit einer Zelldichte von 150.000 - 200.000 Zellen/cm2.
- Neu plattierte ESNs bei 37 °C und 5 % CO2 in einen befeuchteten Gewebekultur-Inkubator überführen und wie in Abschnitt 3 aufbewahren.
>2. Vorbereiten von Kulturoberflächen für die Beschichtung von neuronalen Vorläufern bei DIV 0
- Bereiten Sie mit Gewebekulturen behandelte Gerichte mindestens 1 Tag vor dem Anrichten zu. Ausreichend Polyethylenimin (PEI; 25 μg/ml in sterilem H2O) oder Poly-D-Lysin (PDL; 100 μg/ml in sterilem H2O) zugeben, um mit Gewebekulturen behandelte Kunststoffschalen abzudecken und O/N bei 37 °C zu inkubieren.
- Am Morgen des Anrichtens das Geschirr zweimal mit doppelt destilliertem H2O und einmal mit PBS spülen. Fügen Sie nach dem letzten Waschen ausreichend N2-Medium hinzu, um die Schale zu bedecken (z. B. 1 ml pro Mulde einer 12-Well-Schale oder 4 ml pro 6-cm-Schale).
Bereiten Sie mindestens - einen Tag vor der Neuronenbeschichtung 18-mm-Glasdeckgläser vor. Reinigen Sie die Deckgläser durch Plasmareinigung für 4 Minuten.
- Gereinigte Deckgläser sofort auf einen mit Ethanol gewaschenen Parafilm am Boden einer großen sterilen Schale geben und 400 μl PEI- oder PDL-Lösung hinzufügen, die wie in Schritt 2.1 vorbereitet wurde. Inkubieren Sie O/N bei 37 °C in einem Gewebekultur-Inkubator.
- Waschen Sie die Deckgläser morgens dreimal mit Wasser und fügen Sie 5 μg/ml Laminin in PBS für 1 - 3 Stunden bei 37 °C hinzu. Bevor Sie Neuronen dissoziieren, aspirieren Sie das Laminin und geben Sie das Deckglas sofort in eine Vertiefung einer 12-Well-Schale mit 1 ml NPC-Medium, wobei Sie darauf achten müssen, dass die behandelte Seite nach oben zeigt.
- Lagern Sie Geschirr und Deckgläser bei 37 °C, bis die NPCs zum Anrichten bereit sind.
>3. Wartung von Neuronen
- Bei DIV 1 das Medium aspirieren und durch N2-Kulturmedium ersetzen.
- Bei DIV 2 und 4 das Medium aspirieren und durch B27-Kulturmedium ersetzen.
- Bei DIV 8 wird das Medium aspiriert und durch B27-Kulturmedium ersetzt, das mitotische Inhibitoren enthält, um kontaminierende nicht-neuronale Zellen zu eliminieren.
- Bei DIV 12 durch B27-Nährmedium ersetzen.
- Entfernen Sie DIV 12+ ESNs ab 5 % CO2 -Gehalt nicht, bis sie einsatzbereit sind.
