Magnetische Trennung von Schwann-Zellen von Ischiasnerven der Maus

Zusammenfassung

Quelle: Blusch, A., et al., In-vitro-Myelinisierung peripherer Axone in einer Kokultur von Explantaten aus Spinsalwurzelganglien der Ratte und Schwann-Zellen. J. Vis. Exp. (2023)

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung von Schwann-Zellen aus Ischias-Nervenfasern von Mäusen.

Protokoll

>1. Schwann-Zellkultur

1. Beschichtung für Schwann-Zellkultur
   1. Beschichten Sie die Zellkulturschalen unter sterilen Bedingungen. 2 ml 0,01 % Poly-L-Lysin (PLL) auf jeweils zwei 60-mm-Gewebekulturschalen (TC) geben und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   2. Entfernen Sie die PLL, waschen Sie das TC-Geschirr 2x mit destilliertem Wasser und inkubieren Sie es über Nacht bei 4 °C mit 2 mL 1 μg/cm² Laminin. Waschen Sie das TC-Geschirr 2x mit Aqua Dest und lassen Sie die Platten an der Luft trocknen.
2. Mediumvorbereitung für die Schwann-Zellkultur
   1. Bereiten Sie 50 ml Schwann-Zellmedium vor, indem Sie 10 % hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FCS), 2 μM Forskolin, 10 nM Neuregulin und 50 μg/ml Gentamycin zu Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/F-12 (hoher Glukosegehalt) unter sterilen Bedingungen hinzufügen.
   2. Bereiten Sie 70 mL des L-15-Mediums von Leibovitz mit 50 μg/ml Gentamycin unter sterilen Bedingungen vor.
3. Enzymatische Verdauung des Ischiasnervs
   HINWEIS: Die nächsten Schritte werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
   1. Bereiten Sie die enzymatische Aufschlusslösung vor, die 0,25 % Dispase II, 0,05 % Typ-I-Kollagenase und 50 μg/ml Gentamycin in 10 ml DMEM (hoher Glukosespiegel) enthält.
   2. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 188 x g für 5 min bei 4 °C, entfernen Sie den Überstand mit einer serologischen 25-ml-Pipette und überführen Sie das Pellet mit dem restlichen L-15-Medium von Leibovitz unter Verwendung einer 1.000-ml-Pipette in eine 60-mm-Gewebekulturschale.
   3. Spülen Sie das 50-ml-Röhrchen mit 10 mL der enzymatischen Aufschlusslösung und geben Sie sie in die Schale mit den Nervenfasern. Verteilen Sie das Gewebe vorsichtig mit der Spitze einer Pipette in der Schale, um die für die Verdauung zugängliche Oberfläche zu maximieren.
   Bei
   4. 37 °C und 5 % CO₂ 18 h inkubieren und den Aufschluss durch Zugabe von 10 ml 40 % FCS in Hanks' ausgewogener Salzlösung ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ (HBSS) stoppen.
4. Zelltrennung
   1. Die verdauten Nerven werden mit einer serologischen Pipette in ein 50-ml-Röhrchen überführt und 10 Minuten lang bei 4 °C bei 188 x g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet in 10 ml DMEM mit 10 % FCS und 50 μg/ml Gentamycin resuspendiert. Resuspendieren Sie das Pellet anschließend 20 Mal mit einer Pipettenspitze von 10 mL, 5 mL, 2 mL, 1 mL und 200 μL.
   2. Die Zellsuspension wird durch ein 100 μm Zellsieb filtriert und 10 min bei 4 °C bei 188 x g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet mit 4 mL DMEM mit 10 % FCS und 50 μg/ml Gentamycin resuspendiert.
   3. Geben Sie je 2 ml der Zellsuspension in jede der beiden PLL- und Laminin-beschichteten 60-mm-TC-Schalen und inkubieren Sie bei 37 °C und 5 % CO₂. Lassen Sie die Platten 2 Tage lang unberührt im Inkubator, um die Zellen vor mechanischer Beanspruchung zu schützen und die Adhärenz zu unterstützen.
5. Differenzierung der Schwann-Zellen
   1. Entfernen Sie nach 2 Tagen das Medium und spülen Sie die Platten 2x vorsichtig mit DMEM (hoher Glukosespiegel), 10 % FCS und 50 μg/ml Gentamycin aus. Fügen Sie anschließend 2 mL Schwann-Zellmedium hinzu. Tauschen Sie das Schwann-Zellmedium jeden 2. Tag aus und beobachten Sie das Aussehen und die Konfluenz der Zellen mit einem Mikroskop.
6. Zelltrypsinisierung und magnetische Trennung
   1. Wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 80 % erreichen (6-12 Tage Kultur), waschen Sie die Platten vorsichtig 2x mit 3 mL DPBS und inkubieren Sie mit 2 mL 0,05 % Trypsin/EDTA (auf 37 °C vorgewärmt) für 3 min. Wenn sich die Zellen vom Plattenboden lösen, inaktivieren Sie den Verdau durch Zugabe von 2 ml DMEM mit 10 % FCS und 50 μg/ml Gentamycin.
      Anmerkung: Halten Sie sich an eine Trypsinisierungszeit von strikt 3 Minuten und fahren Sie danach schnell fort.
   2. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 2 ml magnetischem Zelltrennungspuffer, der DPBS mit 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 nM EDTA enthält. Kombinieren Sie 10 μl der Zellsuspension mit 10 μl Trypanblau und zählen Sie die Zellen in einer Färbekammer.
   3. Die Zellsuspension wird bei 10 min bei 4 °C bei 188 x g zentrifugiert und das Zellpellet in 90 μl magnetischem Zellseparationspuffer pro 1 x 10⁷ Zellen resuspendiert. Fügen Sie 10 μl Thy-1 Mikrokügelchen pro 1 x 10⁷ Zellen hinzu. Die Lösung einige Male resuspendieren und 15 min im Dunkeln bei 8 °C inkubieren.
   4. Geben Sie 2 mL des magnetischen Zelltrennpuffers in die Zellsuspension und zentrifugieren Sie bei 300 x g für 10 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl magnetischem Zelltrennpuffer
   .
   5. Befeuchten Sie die magnetische Zelltrennsäule mit 1 mL des magnetischen Zelltrennpuffers. Setzen Sie die magnetische Zelltrennsäule in den magnetischen Zellseparator ein. Legen Sie die Zellen auf die magnetische Zelltrennsäule. Den Durchfluss auffangen und bei 300 x g bei 4 °C für 10 min.
      zentrifugieren Anmerkung: Fibroblasten werden positiv selektiert und verbleiben in der Säule, während Schwann-Zellen die Säule passieren. Fibroblasten können mit einem Stempel entnommen werden (z.B. als Negativkontrolle für Schwann-Zell-Färbeprotokolle).
   6. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml des Kokulturmediums. Zählen Sie die Zellen nach der Färbung mit Trypanblau und einer Färbekammer.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Rinderserumalbumin	Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland	8076.4
Zellsieb, 100 μM	BD Bioscience, Heidelberg, Deutschland	Artikel-Nr.: 352360
Zentrifuge 5810-R	Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland	5811000015
CO2-Inkubator Heracell	Heraeus Instruments, Hanau, Deutschland	51017865
Dispase II	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Deutschland	4942078001
Destilliertes Wasser (Wasseraufbereitungssystem)	Millipore, Molsheim, Frankreich	ZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland	31331093
DPBS (keine Calcium-Ionen und keine Magnesium-Ionen)	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Deutschland	D8537-6X500ML
Fcs	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Deutschland	Nr. F7524	FCS muss auf Schwann-Zellkultur getestet werden
Gentamycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland	5710064
HBSS (keine Calcium-Ionen und keine Magnesium-Ionen)	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland	14170138
Laminin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Deutschland	L2020-1MG
MACS Multistand	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland	130042303
Mikroschere	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Deutschland	Nr. 15000-08
Mikroskop	Motic, Wetzlar, Deutschland	Motic BA 400
Objektträger für Mikroskop	VWR, Radnor, USA	Nr. 630-1985
MiniMACS-Trennzeichen	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland	130091632
MS-Spalten	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland	Artikel-Nr.: 130-042-201
Neubauer Zählkammer	Assistentin, Erlangen, Deutschland	Artikel-Nr.: 40441
Pipetten	Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland	2231300004
Poly-L-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Deutschland	Nr. P4707-50ML
Serologische Pipette, 10 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland	861254025
Serologische Pipette, 25 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland	861685001
Serologische Pipette, 5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland	861253001
TC-Schüssel 60, Zelle +	Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland	833901300
Thy-1 Mikrokügelchen (MACS-Kit)	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland	Tel.: 130-094-523
Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland	Artikel-Nr.: 25300-054
Kollagenase Typ I	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Deutschland	Um 1639
Wasserbad Typ 1008	GFL, Burgwedel, Deutschland	Nr. 4285

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