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Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.
>1. Herstellung von Schnittlösung mit hohem Saccharosegehalt und künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF)
- Vor dem Experimentiertag
- Bereiten Sie 1 l 10x Scheiben-Vorlösung mit Typ-1-Wasser in Laborqualität vor, das (in mM) enthält: 25 KCl, 20 CaCl2, 10 MgSO4, 12,5 KH2PO4 (Tabelle 1). Um eine Ausfällung von Calciumphosphat zu verhindern, mischen Sie die Chemikalien in einem mit 800 mL H2O vorgefüllten Becherglas langsam unter ständigem Rühren mit einem Magnetrührer. Lagern Sie die Lösung bei 4 °C oder Raumtemperatur (RT).
- Am Experimentiertag
- Bereiten Sie 1 l 1x ACSF mit Typ-1-Wasser in Laborqualität vor, das (in mM) enthält: 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgSO4, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 25 Glukose (Tabelle 2). Verwenden Sie ein Dampfdruckosmometer, um die Osmolarität zwischen 305–315 mOsm (pH ~ 7,55–7,6) zu validieren.
Anmerkung: Um eine Ausfällung von Calciumphosphat zu verhindern, mischen Sie alle festen Chemikalien in einem mit 800 mL H2O vorgefüllten Becherglas langsam unter ständigem Rühren mit einem Magnetrührer. Ganz zum Schluss MgSO4 und CaCl2 zugeben und dabei langsam die erforderliche Menge aus 1 M Stammlösungen eintropfen lassen.
- Kontinuierlich 1x ACSF-Lösung bei RT mit Carbogen sprudeln, um den pH-Wert zwischen 7,3–7,4.
einzustellen
Anmerkung: Ist der pH-Wert etwas zu hoch oder zu niedrig, wären kleine Anpassungen in der Karbogenationsstärke ausreichend. Wenn der pH-Wert mit Aufkohlung höher als 7,45 ist, stellen Sie ihn durch Zugabe einiger Tropfen 1 M NaH2PO4 Lösung ein.
- Bereiten Sie 250 ml (pro Gehirn) 1x Scheibenlösung mit hohem Saccharosegehalt in einem Becherglas vor, das 25 ml 10x Scheibenvorlösung und (in mM): 252 Saccharose, 26 NaHCO3 und 10 Glukose enthält (Tabelle 3). Stellen Sie sicher, dass die Osmolarität zwischen 320 und 325 mOsm (pH ~ 7,55 bis 7,6) liegt.
- Lassen Sie die Scheibenlösung mit hohem Saccharosegehalt 10–15 Minuten lang mit Carbogen sprudeln, um den pH-Wert zwischen 7,3–7,4.
zu kontrollieren
Anmerkung: Wenn der pH-Wert mit Carbogenation höher als 7,45 ist, stellen Sie ihn durch Zugabe einiger Tropfen 1 M KH2PO4 Lösung ein.
- Lagern Sie die Scheibenlösung mit hohem Saccharosegehalt 20–30 Minuten im Ultratiefkühlschrank (-80 °C), bis sie teilweise gefroren ist.
2. Dissektion und Positionierung des murinen Gehirns
- Übertragen Sie das Gehirn in die gekühlte 35-mm-Kulturschale und entfernen Sie alle Haar- oder Blutpartikel aus dem Gewebe, indem Sie das Gehirn vorsichtig mit einer ACSF-gefüllten Pasteur-Pipette waschen (Blut hat zytotoxische Wirkungen auf das Gehirngewebe).
- Übertragen Sie das Gehirn mit Hilfe des Spatels auf das getränkte Filterpapier auf die gekühlte 90-mm-Kulturschale (Abbildung 1A).
- Schneide das Gehirn mit einer Klinge in zwei Hälften, trenne die beiden Hemisphären und lege beide Hemisphären auf die frisch geschnittene mediale Seite.
- Verwenden Sie eine Klinge, um den dorsalen Teil (5 %–10 %) des Gehirns von jeder Hemisphäre mit einem parallelen Schnitt zur dorsalen Oberseite zu entfernen (Abbildung 1C) und platzieren Sie beide Hemisphären auf der frisch geschnittenen Seite, wobei der ventrale Teil des Gehirns nach oben zeigt.
- Positionieren Sie einen Tropfen Sekundenkleber auf der Probenplatte und verteilen Sie ihn mit einer Pipettenspitze richtig, um beide Hemisphären aufzunehmen.
- Verwenden Sie ein Filterpapierband, um eine Hemisphäre mit Kapillarkräften aufzunehmen, indem Sie die Bauchseite mit dem Filterpapierband berühren, wodurch das Gewebe nicht beschädigt wird.
- Verwenden Sie ein weiteres Filterpapierband, um die dorsale Seite des Gehirns vorsichtig halb zu trocknen, bevor Sie die Hemisphäre mit der Rückenseite nach unten auf den Kleber auf der Probenplatte legen. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang mit der zweiten Hemisphäre.
Anmerkung: Die Halbkugeln sollten in horizontaler Ausrichtung gespiegelt auf der Vibratomplatte positioniert werden, wobei die rostralen Seiten nach außen zeigen und die kaudalen Seiten einander in der Mitte zugewandt sind (sich aber nicht berühren). Die medialen Seiten beider Hemisphären sollten in Richtung der Vibratomklinge und die lateralen Seiten in Richtung des Experimentators zeigen (Abbildung 1D).
- Legen Sie die Probenplatte in die Schneidekammer und bedecken Sie sie schnell, aber vorsichtig mit eiskaltem, hochsaccharosereichem Scheibenlösungsmatsch. Sobald die Lösung den Kleber berührt, verfestigt sie sich und verklebt die Halbkugeln ordnungsgemäß mit der Probenplatte.
- Vergewissern Sie sich, dass die Halbkugeln ordnungsgemäß mit einer Scheibenlösung mit hohem Saccharosegehalt bedeckt sind, und vergewissern Sie sich, dass die Lösung mit Carbogen
Anmerkung: Die gesamte Dissektion sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden. Bitte achten Sie darauf, dass das Gehirn nicht sehr lange ohne die Versorgung mit Sauerstoff bleibt. Von der Enthauptung bis zum Eintauchen des Gehirns in den Slush mit hoher Saccharosescheibenlösung sollte es nur etwa 1–1,5 Minuten dauern. Dies ist die wichtigste Anforderung an die Präparation von akuten Hirnschnitten, um eine hohe Qualität der Schnitte zu gewährleisten.
>3. Horizontales Schneiden des Gehirns
- Positionieren Sie die Vibratolem-Klinge vor der medialen Seite der Halbkugeln und senken Sie sie auf die gleiche Höhe ab wie die ventralen Seiten der Hemisphären, die nun nach oben zeigen. Senken Sie die Klinge mit Hilfe der Vibratomensteuerung auf 600 μm weiter in dorsaler Richtung ab und beginnen Sie mit dem Schneiden. Die Klinge sollte das Taschentuch treffen (wenn nicht, drehen Sie die Klinge um und senken Sie sie etwas mehr). In Scheiben schneiden, bis die ersten beiden Scheiben vollständig von den beiden Hemisphären getrennt sind.
- Drehen Sie die Klinge um und senken Sie sie weitere 300 μm ab und schneiden Sie erneut.
- Wenn der Hippocampus sichtbar wird (ggf. den Maushirnatlas zur Hilfe nehmen) (Abbildung 1E) die Scheiben mit der verbreiterten Pasteurpipette aus Kunststoff einsammeln. Sammeln Sie die Scheiben, bis das Caudatus Putamen neben dem Hippocampus sichtbar wird. In der Regel können zwischen 8 und 12 Scheiben von 300 μm (4 bis 6 pro Hemisphäre) für das Gehirn der Maus entnommen werden.
- Verwenden Sie die Pasteurpipette aus Kunststoff, um die Scheiben zu sammeln und in die Auffangkammer im Wasserbad zu überführen (Abbildung 1F) (sammeln Sie die Scheiben nach jeder Schneiderunde, um zu verhindern, dass sie in der Scheibenkammer herumschwimmen).
Anmerkung: Arbeiten Sie so schnell wie möglich und stellen Sie sicher, dass die Scheibenlösung mit hohem Saccharosegehalt während des gesamten Eingriffs eiskalt und karbogenisiert ist. Füllen Sie bei Bedarf das Eis um die Scheibenkammer herum auf.
>4. Wiederherstellung von Hirnschnitten für elektrophysiologische Aufzeichnungen
- Lassen Sie die Scheiben in der mit ACSF gefüllten Auffangkammer im 32 °C warmen Wasserbad für 1 h.
HINWEIS: Rückgewinnungskammern sind auch im Handel erhältlich.
- Nehmen Sie die Auffangkammer aus dem Wasserbad.
- Legen Sie die Scheiben zur Erholung mindestens weitere 30 Minuten bei RT, bevor Sie mit der weiteren Anwendung beginnen.
Puffer- und Medienrezepte.
Tabelle 1: 10 x Scheibe Vorlösung (1 L).
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
| Verbindung | Konzentration (mM) | Molekulargewicht (g/mol) | Menge (g) |
| Kcl | 25 | 74,55 | 1,86 |
| CaCl2 * 2H2O | 20 | 147,01 | 2,94 |
| MgSO4 * 7H2O | 10 | Artikel-Nr.: 246,48 | 2,46 |
| KH2PO4 | 12,5 | 136,08 | 1,7 |
Tabelle 2: 1x ACSF (1 L) (Osmolarität zwischen 305–315 mOsm).
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
| Verbindung | Konzentration (mM) | Molekulargewicht (g/mol) | Menge (g) |
| NaCl | 125 | 58,44 | 7,3 |
| Kcl | 2,5 | 74,55 | 0,19 |
| CaCl2 * 2H2O | arabische Ziffer | ab 1 M CaCl2 Lösung | 2 mL |
| MgSO4 * 7H2O | 1 | ab 1 M MgSO4 Lösung | 1 mL |
| NaH2PO4 * 2H2O | 1,25 | 156,02 | 0,2 |
| NaHCO3 | 26 | 84,01 | 2,18 |
| Glukose *H 2O | 25 | 198,17 | 4,95 |
Tabelle 3: 1x High-Saccharose-Scheibenlösung (250 mL) (Osmolarität zwischen 320–325 mOsm).
kg
Uhr
kg
kg
kg
kg
| Verbindung | Konzentration (mM) | Molekulargewicht (g/mol) | Menge (g) |
| 10x Schicht-Vorlösung | N/A | N/A | ca. 25 mL |
| Saccharose | 252 | 342,3 | 21,57 |
| NaHCO3 | 26 | 84,01 | 0,55 |
| Glukose *H 2O | 10 | 198,17 | 0,49 |
