Erzeugung von gekippten Amygdala-Schnitten aus einem Mausgehirn

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Bosch, D., et al. Ex vivo optogenetische Dissektion von Angstschaltkreisen in Hirnschnitten. J. Vis. Exp. (2016)

Das Video zeigt die Erzeugung von gekippten Amygdala-Schnitten aus einem Mäusegehirn. Das Gehirn wird schräg auf dem Vibratom-Probentisch positioniert, um Schnitte zu erhalten, die die Amygdala und Axone aus dem medialen präfrontalen Kortex enthalten, die synaptische Verbindungen mit der Amygdala bilden. Die Hirnschnitte werden auf der physiologischen Temperatur gehalten, um das Gewebe für weitere Experimente zu erhalten.

Protokoll

Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

>1. Vorbereitung von akuten Schnitten

Bereiten Sie künstliches Liquor (ACSF), Schneidlösung, Werkzeuge (Schere, Skalpell, Pinzette, Spatel, Pasteurpipette) und Agarblöcke vor.
Hinweis: Pro Versuch ist 1 l künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) erforderlich, die durch Auflösen von Chemikalien in doppelt destilliertem H₂O hergestellt wird, wie zuvor veröffentlicht. Die Schneidlösung wird durch Zugabe von 200 ml ACSF mit 0,87 ml 2 M MgSO₄ Stammlösung hergestellt.
ACSF und Schneidlösung während des gesamten Versuchs mit 95 % O₂ und 5 % CO 2 mit Sauerstoff versorgen_.
Betäuben Sie die Maus mit einem Kleintieranästhesiegerät mit Isofluran (3% Sauerstoff). Überprüfen Sie die Anästhesietiefe mit dem Gliedmaßen-Rückzugsreflex, bevor Sie fortfahren.
Enthaupten Sie die Maus mit einer großen Schere und kühlen Sie den Kopf sofort in eiskalter Schneidlösung.
Öffnen Sie den Schädel durch einen einzigen Schnitt in der Mittellinie von kaudal nach rostral und schieben Sie Schädelstücke mit einer Pinzette vorsichtig zur Seite. Entfernen Sie schnell das Gehirn, indem Sie es mit einem kleinen, abgerundeten Spatel vorsichtig aus dem Schädel heben. Kleinhirn mit Skalpell abschneiden. Legen Sie das Gehirn in eiskalte Schneidlösung.
Für den medialen präfrontalen Kortex oder mPFC-Injektionsstellen: Schneiden Sie den vorderen Teil des Gehirns (mPFC-haltig) mit einem Skalpell ab und legen Sie ihn bis zum Schneiden in eiskalte Schneidlösung.
Überschüssige Schneidlösung mit Filterpapier entfernen und den hinteren Teil des Gehirns auf das Vibratomstadium kleben.
Für gekippte Amygdala-Scheiben kleben Sie das Gehirn auf einen Agarblock (4%), der in einem 35°-Winkel geschnitten ist (Abbildung 1D, Mitte). Bei koronalen Amygdala-Schnitten, medialen Nucleus geniculatus / posterior intralaminarem Nucleus thalamicus (MGm/PIN) und mPFC-Injektionsstellen kleben Sie das Gehirn direkt auf den Tisch (Abbildung 1D, links und rechts). Platzieren Sie einen zusätzlichen Agarblock hinter dem Gehirn, um die Stabilität beim Schneiden zu gewährleisten.
Stellen Sie den Tisch in eine Schneidkammer mit eiskalter, sauerstoffhaltiger Schneidlösung, die mit einer Kühleinheit auf 4 °C gehalten wird. Bereiten Sie spitze Scheiben der Amygdala (320 μm) mit einer Saphirklinge vor. Legen Sie die Scheiben in eine Grenzflächenkammer, die mit sauerstoffhaltigem ACSF bei Raumtemperatur (RT) versorgt wird.
Nach der Vorbereitung der akuten Amygdala-Schnitte die Grenzflächenkammer 35 - 45 Minuten lang in ein Wasserbad bei 36 °C legen, um die Scheiben zu gewinnen. Setzen Sie anschließend die Schnittstellenkammer wieder auf RT zurück.
Zu Beginn von Schritt 1.10 werden die Injektionsstellen in Scheiben geschnitten, wie sie zuvor für akute Amygdala-Schnitte beschrieben wurden (Schritte 1.8 - 1.9). Eine Rückgewinnung der Scheiben im Wasserbad ist hier nicht erforderlich. wahlfrei: Um die Position der Injektionsstelle schnell zu bestimmen, beobachten Sie die Schnitte auf einem Stereoskop, das mit einer Leuchtstofflampe und geeigneten Filtersets ausgestattet ist.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

figure-results-1
Abbildung 1. Stereotaktische Injektionen, Präparation von akuten Hirnschnitten und Visualisierung präsynaptischer Fasern.(A, B) Stereotaktische Virusinjektion. A) Bild einer anästhesierten Maus, die in einen stereotaktischen Rahmen gelegt wurde, mit freiliegendem Schädel und der Injektionspipette. Einschub: Vergrößern Sie das Bild einer Injektionspipette, die mit Viruslösung gefül...