Generierung eines koronalen Hirnschnitts, der die Amygdala-Regionen aus einem Mausgehirn freilegt

Abstract

Quelle: Bosch, D., et al. Ex vivo optogenetische Dissektion von Angstschaltkreisen in Hirnschnitten. J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video zeigt die Präparation dünner koronaler Hirnschnitte aus einem Mausgehirn, wobei die Amygdala-Regionen, die reich an synaptischen Verbindungen aus dem medialen präfrontalen Kortex sind, freigelegt werden. Die Scheiben werden dann in sauerstoffhaltiger künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit gewonnen, um die neuronale Lebensfähigkeit zu erhalten.

Protocol

>1. Vorbereitung von akuten Schnitten

1. Bereiten Sie ACSF, Schneidlösung, Werkzeuge (Schere, Skalpell, Pinzette, Spatel, Pasteurpipette) und Agarblöcke vor.
   HINWEIS: Pro Versuch ist 1 l künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) erforderlich. Wie bereits veröffentlicht, wird ACSF durch Auflösen von Chemikalien in doppelt destilliertem H2O hergestellt. Die Schneidlösung wird durch Zugabe von 200 ml ACSF mit 0,87 ml 2 M MgSO₄ Stammlösung hergestellt.
2. ACSF und Schneidlösung während des gesamten Versuchs mit 95 % O₂ und 5 % CO₂ mit Sauerstoff versorgen.
3. Betäuben Sie die Maus mit einem Kleintieranästhesiegerät mit Isofluran (3% Sauerstoff). Überprüfen Sie die Narkosetiefe mit dem Gliedmaßen-Rückzugsreflex, bevor Sie fortfahren.
4. Enthaupten Sie die Maus mit einer großen Schere und kühlen Sie den Kopf sofort in einer eiskalten Schneidlösung.
5. Öffnen Sie den Schädel durch einen einzigen Schnitt in der Mittellinie von kaudal nach rostral und schieben Sie Schädelstücke mit einer Pinzette vorsichtig zur Seite. Entferne das Gehirn schnell, indem du es mit einem kleinen, abgerundeten Spatel vorsichtig aus dem Schädel hebst. Kleinhirn mit Skalpell abschneiden. Lege das Gehirn in eine eiskalte Schneidlösung.
6. Verwenden Sie für mPFC-Injektionsstellen ein Skalpell, um den vorderen Teil des Gehirns (der mPFC enthält) abzuschneiden, und legen Sie ihn in eine eiskalte Schneidlösung, bis er in Scheiben geschnitten wird.
7. Entfernen Sie die überschüssige Schneidlösung mit Filterpapier und kleben Sie den hinteren Teil des Gehirns auf das Vibratom-Stadium.
8. Bei koronalen Amygdala-Schnitten, MGm/PIN-Injektionsstellen und mPFC-Injektionsstellen kleben Sie das Gehirn direkt auf die Bühne (Abbildung 1D, links und rechts). Platzieren Sie einen zusätzlichen Agarblock hinter dem Gehirn, um die Stabilität beim Schneiden zu gewährleisten.
9. Stellen Sie den Tisch in eine Schneidkammer mit einer eiskalten, sauerstoffhaltigen Schneidlösung, die mit einer Kühleinheit auf 4 °C gehalten wird. Bereiten Sie mit einer Saphirklinge koronale Scheiben der Amygdala vor. Legen Sie die Scheiben in eine Grenzflächenkammer, die mit sauerstoffhaltigem ACSF bei RT versorgt wird.

Results

Abbildung 1. Stereotaktische Injektionen, Präparation von akuten Hirnschnitten und Visualisierung präsynaptischer Fasern. (A, B) Stereotaktische Virusinjektion. A) Bild einer anästhesierten Maus, die in einem stereotaktischen Rahmen platziert wird, wobei der Schädel freigelegt und die Injektionspipette verwendet wird. Einschub: Vergrößern Sie das Bild der Injektionspipette, die mi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF)	Zur Zusammensetzung siehe Referenzen #16 und #23
Interne Patch-Lösungen	Zur Zusammensetzung siehe Referenzen #16 und #23
Schneidemaschine, Microm HM650V	Fisher Scientific, Deutschland	Artikel-Nr.: 920120
Kühlaggregat für Tissue-Slicer, CU65	Fisher Scientific, Deutschland	Artikel-Nr.: 770180
Saphir-Klinge	Delaware Diamantmesser
Stereoskop, SZX2-RFA16	Olympus, Japan