Alle Verfahren, bei denen Proben entnommen werden, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt
>1. Sezieren der DG (Zeit: 15 min)
Bereiten Sie die - Kernisolationsmedien 1 und 2 (NIM1 und NIM2), den Homogenisierungspuffer (HB) und das Waschmedium (WM) vor (Tabelle 1). Legen Sie alle Puffer, Medien, Reagenzien und Werkzeuge bis zur Verwendung auf Eis. Stellen Sie den Dounce Homogenisator (siehe Materialtabelle) während der Zubereitung auf Eis (mindestens 1 h vor dem Homogenisierungsschritt).
Anmerkung: NIM1 kann bis zu 6 Monate bei 4 °C zubereitet und gelagert werden. NIM2, HB und WM sollten frisch zubereitet werden.
Vorsicht: Manipulieren Sie Dithiothreitol (DTT), den Proteasehemmer und Triton X-100 mit Vorsicht. Diese Verbindungen sind haut- und augenreizend, akut giftig und gefährlich für die aquatische Umwelt. Tragen Sie während der Verwendung dieser Chemikalien Schutzhandschuhe, Kleidung, Augen- und Gesichtsschutz, waschen Sie sich nach der Handhabung gründlich die Hände und vermeiden Sie eine Freisetzung in die Umwelt.
- Euthanasieren Sie eine 22 Monate alte männliche C57Bl/6J-Maus durch Gebärmutterhalsluxation nach dem Schedule 1-Verfahren des Innenministeriums.
Anmerkung: Siehe Diskussion für die Begründung bezüglich der Verwendung von 22 Monate alten Mäusen in dieser Studie. Dieses Protokoll kann jedoch in jedem Alter über die gesamte Lebensspanne durchgeführt werden.
- Sezieren Sie das Gehirn einer euthanasierten Maus und übertragen Sie es in eine 10 cm große Petrischale, die mit eiskalter 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefüllt ist (Abbildung 1). Stelle die Petrischale auf Eis. Entfernen Sie das Kleinhirn mit einem Skalpell und schneiden Sie das Gehirn zwischen beiden Hemisphären (entlang der Sagittalachse) in zwei Hälften.
- Füllen Sie eine neue 10 cm Petrischale mit eiskaltem PBS und stellen Sie sie auf Eis. Übertragen Sie eine Hälfte des Gehirns in die neue Petrischale. Präparieren Sie mit einem Fernglas die DG und wiederholen Sie diesen Schritt, um die zweite DG aus der zweiten Hälfte des Gehirns zu erhalten.
Anmerkung: Diese Schritte (Schritte 1.2-1.4) wurden von einer zuvor beschriebenen Vorgehensweise adaptiert. In diesem Stadium ist es wichtig, so schnell wie möglich vorzugehen, um die Integrität der Zellen zu erhalten.
- Übertragen Sie die beiden DGs in den vorgekühlten Dounce-Homogenisator und fügen Sie 1 ml kaltes HB hinzu.
>2. Gewebedissoziation, Isolierung einzelner Kerne und Anti-NeuN-Immunfärbung (Zeit: 2 h)
- Homogenisieren Sie das Gewebe mit 10 Zügen des losen "A"-Stößels, gefolgt von 15 Zügen des festen "B"-Stößels.
Anmerkung: Die Dounce-Homogenisierung sollte mit dem Mörtel auf Eis mit sanften Strichen durchgeführt werden, um die durch Reibung und Schaumbildung verursachte Hitze zu reduzieren. Alle Puffer und Geräte sollten während des Eingriffs vorgekühlt und auf Eis gehalten werden.
- Füllen Sie das Homogenat in ein vorgekühltes 15-ml-Röhrchen; spülen Sie den Dounce Homogenisator mit 1 mL kaltem HB und mischen Sie es in dasselbe Röhrchen. Geben Sie 3 mL HB in das 15-ml-Röhrchen und inkubieren Sie 5 Minuten auf Eis. 2x mischen, indem man die Tube vorsichtig umdreht.
- Befeuchten Sie eine 70-μm-Siebkappe mit 0,5 mL HB über einem 50-ml-Reagenzglas. Die Zellkernsuspension aus Schritt 2.2 wird durch vorsichtiges Umkippen des 15-ml-Röhrchens in das Zellsieb abgeseiht. Waschen Sie das Zellsieb mit 0,5 ml HB.
- Entfernen Sie das Zellsieb und zentrifugieren Sie das Reagenzglas bei 500 x g für 5 min bei 4 °C mit einer Schwenkeimerzentrifuge. Verwerfen Sie den Überstand.
Anmerkung: Das Abseihen des Homogenats trägt dazu bei, die Ablagerungen zu reduzieren, was für die Durchflusszytometrie und die nachgelagerten Schritte der Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) von entscheidender Bedeutung ist.
- Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 4 ml HB mit einer P1000-Pipette. 5 min auf Eis inkubieren. Bei 500 x g für 10 min bei 4 °C schleudern. Den Überstand verwerfen und das Pellet in 3 mL WM resuspendieren.
- Befeuchten Sie eine 35-μm-Siebkappe über einem 15-ml-Reagenzglas mit 0,5 ml WM. Seihen Sie die Kernsuspension aus Schritt 2.5 durch das Zellsieb und pipettieren Sie jeweils 0,5 ml vorsichtig mit einer P1000-Pipette.
- Waschen Sie die Siebkappe mit 0,5 mL WM und stellen Sie das Röhrchen auf Eis. Das Filtrat in ein neues 15 mL Röhrchen umfüllen und für 5 min und 4 °C bei 500 x g zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 3 mL WM.
- Bei 500 x g für 5 min bei 4 °C schleudern. Den Überstand verwerfen und das Pellet in 1 ml WM mit dem antineuronalen nukleären Antigen der Maus (NeuN), dem AlexaFluor 488-konjugierten Antikörper (anti-NeuN-AF488, 1:32.000) und 1 μg/ml 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) resuspendieren. 45 min im Dunkeln auf Eis inkubieren.
Anmerkung: Um die Immunfärbung isolierter Zellkerne zu optimieren, wird empfohlen, den Antikörper zu titrieren, um die optimale Verdünnung für die durchflusszytometrische Analyse und Sortierung zu bestimmen. Führen Sie dann angemessene Kontrollen durch, um zu bestätigen, dass die Färbebedingungen optimal sind. Zum Beispiel wurden mit dem konjugierten Anti-NeuN-AF488-Antikörper eine Negativkontrolle (d. h. keine Zugabe des Antikörpers, Abbildung 2A) und eine Positivkontrolle (d. h. Färbung mit dem Antikörper, Abbildung 2B) durchgeführt, um die Segregation von ungefärbten und gefärbten Populationen zu beurteilen. Wenn Sie mit einem AF488-konjugierten Antikörper arbeiten, wird empfohlen, eine AF488-konjugierte Isotypkontrolle durchzuführen, um die Spezifität zu beurteilen. Wenn ein nicht konjugierter Antikörper verwendet wird, kann eine zusätzliche Kontrolle, wie z. B. das Hinzufügen eines Sekundärantikörpers nur zu einem Kernpräparat, erforderlich sein, um die unspezifische Bindung des Sekundärantikörpers zu beurteilen.
>3. Fluoreszenz-aktivierte Kernsortierung (FANS) zum Ausschluss neuronaler Populationen (Zeit: 45 min)
- Die immungefärbte Zellkernsuspension wird in ein 5-ml-Reagenzglas überführt und bis zum Beginn der Durchflusszytometrie auf Eis gelegt.
Anmerkung: Wenn mit größeren Gewebestücken als zwei Maus-DG gearbeitet wird, kann eine weitere Verdünnung mit WM-Puffer erforderlich sein, um eine Verstopfung des fluoreszenzaktivierten Zellsortierers (FACS) zu vermeiden, wenn die Kerndichte in der Lösung hoch wird.
- Wirbeln Sie die Proben 3 s lang bei niedriger Geschwindigkeit vor, bevor Sie die Röhrchen in das FACS-Gerät einsetzen (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: (FACS-Einrichtung) Sortiermaschinen müssen zu Beginn des Verfahrens gemäß den Empfehlungen des Herstellers auf Kalibrierpartikel ausgerichtet werden. Die Tropfenverzögerung wurde mit Kügelchen oder Mikrosphären (siehe Materialtabelle) nach dem FACS-Modell kalibriert. Die Proben wurden bei 4 °C im Reinheitsmodus sortiert. Um das Sammelvolumen zu reduzieren, wurden die Zellkerne durch eine 70 μm Düse bei dem für das Durchflusszytometer empfohlenen Druck sortiert. Die Zellkerne wurden in 1,5 mL niedrig bindende Röhrchen (siehe Materialtabelle) sortiert, die 50 μl WM enthielten. Alle Entnahmeröhrchen wurden über Nacht bei 4 °C mit PBS + 5 % Rinderserumalbumin (BSA) beschichtet, um das Risiko zu verringern, dass Zellkerne an den Wänden des Röhrchens haften bleiben.
- Um die Daten aus einer Probe der gefärbten Zellkernsuspension zu erhalten, stellen Sie die Gates in DAPI-Höhe und im DAPI-Bereich ein, um die Zelltrümmer und die aggregierten Zellkerne auszuschließen (Abbildung 3A). Trennen Sie darüber hinaus einzelne Kerne von allen verbleibenden DAPI-gefärbten Aggregaten oder Zelltrümmern, indem Sie die Gates im logarithmischen Streubereich (SSC) und im logarithmischen Vorwärtsstreubereich (FSC) setzen (Abbildung 3B).
- Setzen Sie die Gates für den Anti-NeuN-AF488 und den FSC-Bereich, um die NeuN-AF488-negative Population zu isolieren, wie in Abbildung 3C gezeigt.
- Nach der Analyse wird die NeuN-AF488-negative Population mit der oben beschriebenen Gating-Strategie in ein 1,5 ml-Sammelröhrchen sortiert, das mit 50 μl WM.
gefüllt ist
Anmerkung: Nach der oben beschriebenen Gating-Strategie und dem Dissektionsverfahren zur Isolierung des DG aus dem Gehirn einer adulten Maus wird erwartet, dass die NeuN-AF488-negative Population ~14% der einzelnen Kerne ausmacht.
Tabelle 1: Zusammensetzung der in der Studie verwendeten Medien und Puffer.
kg
kg
kg
kg
Uhr
kg
kg
Uhr
kg
| Kernisolationsmedium #1 (NIM1) – bis zu 6 Monate bei 4 °C lagern |
| Bestandteil | Volumen (μL) | Endkonzentration (mM) |
| 1,5 M Saccharose | 1.833,30 | 250 |
| 1 M KCl | 275 | 25 |
| 1 M MgCl2 | 55 | 5 |
| 1 M Tris-Puffer, pH 8,0 | Nr. 110 | 10 |
| Nukleasefreies Wasser | 8.726,70 | - |
| Gesamtvolumen | 11.000 | - |
| Kernisolationsmedium #2 (NIM2) – frisch machen |
| Bestandteil | Volumen (μL) | Endkonzentration |
| NIM1 | 10.769 | - |
| 1 mM DVB-T | 11 | 1 μM |
| 100x Protease-Hemmer | Nr. 110 | 1x |
| Triton X-100 10% (v/v) | Nr. 110 | 0,1 % (v/v) |
| Gesamtvolumen | 11.000 | - |
| Homogenisierungspuffer (HB) – frisch machen |
| Bestandteil | Volumen (μL) | Endkonzentration |
| NIM2 | 10.958,75 | - |
| RNase-Hemmer, 40 U μL-1 | 27,5 | 100 U mL-1 |
| RNasin, 40 HE μL-1 | 13.75 | 50 HE mL-1 |
| Gesamtvolumen | 11.000 | - |
| Waschmittel (WM) |
| Bestandteil | Volumen (μL) | Endkonzentration |
| BSA 7,5 % | 1.466,70 | 1 % |
| RNase-Hemmer, 40 U μL-1 | 27,5 | 100 U mL-1 |
| RNasin, 40 HE μL-1 | 13.75 | 50 HE mL-1 |
| Pbs | 9.492,05 | - |
| Gesamtvolumen | 11.000 | - |
