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Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.
>1. Materialien
- Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor, bevor Sie mit dem Protokoll beginnen:
- Bereiten Sie den Ladepuffer vor, indem Sie fötales Rinderserum (FBS, 2 %) zu phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hinzufügen.
- Fügen Sie PBS neutralroten (NR) Farbstoff (letzte 1%) hinzu.
- Bereiten Sie die folgenden Lösungen mit dem im Handel erhältlichen Gehirndissoziationskit für Erwachsene vor (siehe Materialtabelle).
- Zur Vorbereitung der Enzymmischung 1 pipettieren Sie 1,9 ml Puffer Z und 50 μl Enzym P in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
- Zur Herstellung von Enzymmischung 2 pipettieren Sie 20 μl Puffer Y und 10 μl Enzym A in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Bereiten Sie die Lösung zur Entfernung von Schmutz vor.
>2. Perfusion und Dissektion von Mäusen
- Intraperitoneal (i.p.) injizieren Sie der Maus 2-3 h vor der Anästhesie 500 μl 1% NR-Farbstoff in PBS.
Anmerkung: Die intraperitoneale Injektion von NR in demyelinisierenden Mausmodellen hilft bei der Unterscheidung der Läsionen (Abbildung 1).
- Betäuben Sie die Maus mit Pentobarbital (50 mg/kg, i.p.) und stellen Sie sicher, dass die Maus erfolgreich anästhesiert wird, indem Sie die Schmerzreaktionen untersuchen.
- Öffnen Sie die Brusthöhle der Maus und legen Sie das Herz frei.
- Schneiden Sie vorsichtig eine kleine Ecke des rechten Vorhofs ab und perfundieren Sie die Maus intrakardial mit 20-30 ml kaltem PBS aus dem linken Ventrikel.
- Enthaupten Sie die Maus unter Narkose.
- Öffne den Schädel der Maus und befreie das Gehirn vorsichtig vom Schädel.
- Übertragen Sie das Gehirn in die Scheibenform des Mausgehirns und schneiden Sie das Gehirn in 0,1 cm große Scheiben.
- Entfernen Sie die Hirnschnitte und legen Sie sie in kaltes PBS in eine Petrischale (60/15 mm). Mit einer mikrochirurgischen Pinzette werden die mit dem NR-Farbstoff markierten Läsionen um das Corpus callosum herum unter einem Stereomikroskop mikropräpariert.
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass das präparierte Gewebe so vollständig wie möglich ist, um den anschließenden Transfer zu erleichtern. Der gesamte Präparierfortschritt sollte in 2 Stunden abgeschlossen sein.
- Das präparierte Gewebe wird in 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt, die die entsprechende Menge an Kaltladepuffer enthalten.
Anmerkung: Poolen Sie das Corpus callosum-Gewebe von 2-3 Mäusen in einem Röhrchen als eine Probe.
>3. Dissoziation des Gewebes
- Zentrifugieren Sie das präparierte Gewebe bei 300 ×g für 30 s (nach Erreichen dieser Geschwindigkeit), um die Probe am Boden des Röhrchens zu sammeln.
- Die Enzymmischung 1 und 2 in einem Inkubator auf 37 °C vorheizen.
- 1.950 μl der vorgewärmten Enzymmischung 1 zu einer Probe geben und in einem Inkubator bei 37 °C 5 Minuten lang aufgären.
- Fügen Sie 30 μl vorgewärmten Enzymmix 2 hinzu und mischen Sie vorsichtig.
- In einem Inkubator bei 37 °C 15 min verdauen und alle 5 min vorsichtig mischen.
- Geben Sie nach dem Aufschluss 4 ml kaltes PBS in das Röhrchen und schütteln Sie es vorsichtig.
- Setzen Sie 70 μm Filter auf 50 mL Zentrifugenröhrchen und befeuchten Sie die Filter mit 500 μl kaltem PBS. Das dissoziierte Gewebe wird filtriert, indem die verdauten Gewebeproben durch die Filter geleitet werden, und die gefilterte Suspension wird im 50-ml-Zentrifugenröhrchen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt.
Anmerkung: Überspringen Sie diesen Schritt, wenn die Gewebemenge zu klein ist.
- Die filtrierten Gewebeproben werden bei 300 ×g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand langsam und vollständig abgesaugt.
Anmerkung: Alle Schritte sollten auf Eis durchgeführt werden, mit Ausnahme des enzymatischen Aufschlusses.
>4. Beseitigung von Schutt
- Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig mit 1.550 μl kaltem PBS.
- Fügen Sie 450 μl kalte Lösung zur Entfernung von Schmutz hinzu und mischen Sie gut.
- Überlagern Sie die obige Mischung langsam und vorsichtig mit 2 x 1 mL kaltem PBS unter Verwendung einer 1.000 μl Pipette.
Anmerkung: Kippen Sie das Zentrifugenröhrchen um 45° und fügen Sie PBS langsam mit der Pipette entlang der Röhrchenwand hinzu.
- Das Röhrchen langsam und schonend in eine Zentrifuge geben und bei 4 °C und 3.000 × g 10 min schleudern.
- Suchen Sie nach der Zentrifugation nach drei Schichten. Saugen Sie die beiden oberen Schichten mit einer 1.000-μl-Pipette vollständig ab (Abbildung 2).
- Füllen Sie das Röhrchen bis zu 5 mL mit Kaltladepuffer und drehen Sie das Röhrchen dreimal vorsichtig um.
- Zentrifugieren Sie bei 4 °C und 1.000 × g für 10 min. Saugen Sie den Überstand vollständig an und vermeiden Sie eine Störung des Küvettenpellets.
>5. Magnetische Trennung von Mikrogliazellen
- Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 90 μl Ladepuffer und fügen Sie 10 μl CD11b (Mikroglia)-Kügelchen hinzu.
- Gut mischen und 15 min bei 4 °C inkubieren.
- Fügen Sie 1 ml Ladepuffer hinzu und pipettieren Sie die Flüssigkeit vorsichtig mit einer 1.000-μl-Pipette auf und ab, um die Zellen nach der Inkubation zu waschen. Die Zellen werden bei 4 °C und 300 × g 10 min zentrifugiert und der Überstand vollständig abgesaugt, um die ungebundenen Kügelchen zu entfernen.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μl Ladepuffer.
- Platzieren Sie die MS-Säule mit ihrem Separator zur Positivauswahl in das Magnetfeld.
- Spülen Sie die Säule mit 500 μl Ladepuffer, um die Zellen zu schützen und die Effizienz der magnetischen Sortierung gemäß dem Protokoll des Herstellers zu gewährleisten.
- Tragen Sie die Zellsuspension auf die MS-Säule auf und verwerfen Sie den Durchfluss mit unmarkierten Zellen.
- Geben Sie dreimal 500 μl Ladepuffer in die Säule, um Zellen, die an der Säulenwand haften, wegzuspülen und den Durchfluss zu verwerfen.
Anmerkung: Fügen Sie nur dann einen neuen Ladepuffer für die Reinigung hinzu, wenn der Säulenbehälter leer ist.
- Nehmen Sie die Säule nach dem Waschen der Säule aus dem Separator und stellen Sie sie auf ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
- Geben Sie 1 ml Ladepuffer in die Säule und schieben Sie den Kolben nach unten, um die magnetisch markierten Zellen auszuspülen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal, um die magnetisch markierten Zellen vollständig zu sammeln.
