Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung der Lösung
- NGM-Agar Platten (1 L)
- Fügen Sie 3 g NaCl, 2,5 g Peptonmedium (z. B. Bacto-Pepton) und 20 g Agar hinzu. Nach dem Autoklavieren 1 ml Cholesterin (5 mg/ml in 95 % Ethanol [EtOH]-Stamm), 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 1 M CaCl2, 25 ml 1 M K2PO4 und 1 ml Amphotericin B (2,5 mg/ml Stamm) hinzufügen.
- NGM-Agar RNAi Platten (1 L)
- Fügen Sie 3 g NaCl, 2,5 g Peptonmedium und 20 g Agar hinzu. Nach dem Autoklavieren fügen Sie 1 ml Cholesterin (5 mg/ml in 95% EtOH-Stamm), 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 1 M CaCl2, 25 ml 1 M K2PO4, 1 ml Amphotericin B (2,5 mg/ml) Stamm, 1 ml 1 M Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) und 1 ml Carbenicillin (50 mg/ml) hinzu.
- Luria-Bertani (LB)-Agar (1 L)
- Fügen Sie 10 g Peptonmedien, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 20 g Agar, 10 ml 1 M Tris pH 8,0 hinzu. H2O auf 1 L geben. Nach dem Autoklavieren 1 ml 50 mg/ml Carbenicillin und 2,5 ml 5 mg/ml Tetracyclin hinzufügen.
- LB Medium (1 L)
- Fügen Sie 10 g Peptonmedien, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl und 10 ml 1 M Tris pH 8,0 hinzu. H2O auf 1 L geben. Nach dem Autoklavieren 1 ml 50 mg/ml Carbenicillin hinzufügen.
- M9-Puffer (1 L)
- 6,0 g Na2HPO4, 3 g K2PO4, 5 g NaCl und 50 mg Gelatine hinzufügen. Vor der Anwendung 1 mL 1 M MgSO4 hinzufügen.
- Bleichlösung (10 mL)
- Fügen Sie 1 mL NaClO und 2 mL 5 N NaOH hinzu. Fügen Sie H2O zu 10 mL hinzu.
>2. Vorbereitung von RNAi-Platten
Hinweis: C. elegans wird typischerweise im Labor auf 6 cm Petriplatten kultiviert, die 7,5 mL Nematode Growth Medium Agar (NGM-Agar) enthalten. Dieses Protokoll ist für Würmer optimiert, die bei 15 °C gehalten werden. Um Platten mit NGM vorzubereiten, verwenden Sie sterile Standardtechniken, um eine Pilz- und Bakterienkontamination zu verhindern. Im Folgenden finden Sie das Protokoll zur Herstellung von NGM-Platten, die mit Reagenzien für RNAi ergänzt werden.
- Bereiten Sie 6-cm-NGM-Agar-RNAi-Platten vor, die 1 mM IPTG und 50 μg/ml Carbenicillin enthalten. Lassen Sie sie 24 – 48 h bei Raumtemperatur im Dunkeln trocknen.
- Bewahren Sie RNAi-Platten bei 4 °C im Dunkeln auf. Nicht verwenden, wenn sie älter als 14 Tage sind.
- Wählen Sie den Klon des RNAi-Bakteriums (Escherichia coli HT115), der das Plasmid L4440 mit der DNA-Sequenz des Lin-53-Gens enthält, aus dem gefrorenen Glycerinbestand aus der verfügbaren RNAi-Bibliothek13 auf LB-Agarplatten, die 50 μg/ml Carbenicillin und 12,5 μg/ml Tetracyclin enthalten, unter Verwendung des Drei-Phasen-Streifenmusters. Züchten Sie die Bakterien über Nacht bei 37 °C. Dieser Klon ermöglicht die IPTG-abhängige Produktion von lin-53 dsRNA in den Bakterien.
- Darüber hinaus können RNAi-Bakterien, die das L4440-Plasmid enthalten, ohne dass eine Gensequenz als leere Vektorkontrolle vorhanden ist.
- Am nächsten Tag wird eine einzelne Kolonie aus lin-53 oder leeren Vektor-LB-Agarplatten mit einer 200-μl-Pipettenspitze entnommen und jede von ihnen in ein separates Kulturröhrchen mit 2 ml flüssigem LB-Medium geimpft, das mit 50 μg/ml Carbenicillin ergänzt wird. Züchten Sie die Kulturen über Nacht bei 37 °C, bis sie bei 600 nm eine optische Dichte (OD) von 0,6 – 0,8 erreichen. Messen Sie den Außendurchmesser mit einem Spektralphotometer.
ACHTUNG: Das flüssige LB-Medium sollte im Gegensatz zu der LB-Agarplatte, die zum Abscheiden der Bakterien aus dem Glycerinbestand verwendet wird, kein Tetracyclin enthalten, da die Aufnahme von Tetracyclin während der Fütterung zu einer verminderten RNAi-Effizienz führt.
- Geben Sie 500 μl jeder Bakterienkultur (lin-53 oder leerer Vektor) mit einer Multipipette auf 6 cm NGM-Agar-RNAi-Platten. Platten mit geschlossenem Deckel über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln zum Trocknen inkubieren. Während dieser Zeit induziert das IPTG in den NGM-Platten die Produktion von dsRNA in den Bakterien.
- Verwenden Sie mindestens 3 Platten pro Bakterienkultur und Experiment. Dadurch werden 3 technische Replikate für jedes Experiment bereitgestellt.
- Lagern Sie getrocknete NGM-Agar-RNAi-Platten mit Bakterien bei 4 °C im Dunkeln bis zu zwei Wochen.
>3. Vorbereitung von C. elegans Stamm BAT28
- Der Wurmstamm BAT288, der die Transgene otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] und ntIs1 [gcy-5prom::gfp] enthält, wird auf OP50-Bakterien mit Standard-NGM-Agarplatten bei 15 °C gehalten
Hinweis: Für ein detailliertes Protokoll zur Nematodenkultur siehe. Das rol-6(su1006) ist ein dominantes Allel und ein häufig verwendeter phänotypischer Injektionsmarker16, der die typische Rollbewegung verursacht. Es wird im otIs305-Transgen verwendet, um hsp-16.2prom::che-1 zu verfolgen.
- Halten Sie den BAT28-Stamm immer bei 15 °C, um eine vorvorsichtige Aktivierung des hsp-16.2prom::che-1-Transgens zu verhindern. Reduzieren Sie die Exposition gegenüber Temperaturen über 15 °C und bewältigen Sie die Belastung so weit wie möglich.
- Um das Alter von Würmern zu synchronisieren, verwenden Sie die Bleichtechnik.
- 6 cm NGM-Agar-Platten mit adulten und Eiern von BAT28 mit 900 μL M9-Puffer abwaschen. Pelletschnecken durch Zentrifugieren bei 900 x g für 1 min. Entfernen Sie den Überstand.
- Fügen Sie 0,5 – 1 ml Bleichlösung hinzu und schütteln Sie das Röhrchen ca. 1 Minute lang, bis adulte Würmer aufplatzen. Überwachen Sie mit einem Standard-Stereomikroskop.
- Pelletschnecken durch Zentrifugieren bei 900 x g für 1 Min. Den Überstand entfernen.
- Waschen Sie das Wurmpellet 3 Mal, indem Sie 800 μl M9-Puffer hinzufügen und bei 900 x g zentrifugieren.
- Legen Sie die gesäuberten Eier auf frische NGM-Platten, die mit OP50-Bakterien besiedelt sind. Züchten Sie eine gebleichte Population mit OP50-Bakterien bei 15 °C, bis sie das L4-Stadium erreichen (ca. 4 Tage). L4-Larven sind mit einem Standard-Stereomikroskop an einem weißen Fleck etwa in der Mitte der ventralen Seite des Wurms zu erkennen18.
Anmerkung: Um den Phänotyp der Umwandlung von Keimzellen in Neuronen nach Depletion von lin-53 zu erreichen, muss es in der elterlichen Generation (P0) depletiert werden. Die Bewertung des Konversionsphänotyps erfolgt in der folgenden Generation (Filialgeneration F1). Um den bereits im P0 vorhandenen Abbau von lin-53 zu erreichen, werden L4-Tiere RNAi unterzogen.
- Übertragen Sie manuell 50 Würmer im L4-Stadium pro Replikat mit einem Platindraht auf eine NGM-Platte, die keine Bakterien enthält, und lassen Sie die Würmer von allen übertragenen OP50-Bakterien wegwandern. Lassen Sie die Würmer etwa 5 Minuten lang auf dem Teller wandern. Verwenden Sie Bakterien aus den NGM-Agar RNAi-Platten, die zuvor mit lin-53 RNAi-Bakterien besiedelt wurden (oder eine leere Vektorkontrolle), um sie auf die jeweiligen RNAi-Platten zu übertragen.
- Vermeiden Sie die Übertragung von OP50-Bakterien auf die eigentlichen RNAi-Platten. Arbeiten Sie schnell, um die Einwirkzeit der Dehnung bei Temperaturen über 15 °C zu minimieren.
- Inkubieren Sie Würmer auf NGM-Agar-RNAi-Platten bei 15 °C für ca. 7 Tage, bis die F1-Nachkommen der Würmer das L3-L4-Stadium erreichen. Sie lassen sich deutlich von den P0-Tieren unterscheiden, da sie größer und dicker sind als die F1-Nachkommen.
- Überprüfen Sie visuell unter einem Standard-Stereomikroskop, ob F1-Nachkommenwürmer den Phänotyp der hervorstehenden Vulva (pvul) aufweisen, wie in Abbildung 1 gezeigt. RNAi gegen lin-53 hat pleiotrope Wirkungen und verursacht den pvul-Phänotyp, der zur Beurteilung des Erfolgs von RNAi gegen lin-53 herangezogen werden kann.
Anmerkung: RNAi gegen lin-53 kann auch zur Letalität von F1-Embryonen führen. Dieser Effekt verstärkt sich, wenn die Platten höheren Temperaturen als 15 °C ausgesetzt werden, bevor die Tiere das Stadium L3 – L4 erreicht haben. Tote Embryonen erkennt man an Entwicklungsstörungen und fehlendem Schlüpfen.
- Inkubieren Sie die Platten im Dunkeln, da IPTG lichtempfindlich ist.
>4. Induktion der Reprogrammierung von Keimzellen
- Inkubieren Sie untersuchte RNAi-Platten, die lin-53 und leere Vektor-RNAi-behandelte F1-Nachkommen enthalten, für 30 min bei 37 °C im Dunkeln, um CHE-1 zu aktivieren. Verwenden Sie einen belüfteten Inkubator, da dies einen effizienteren Hitzeschock ermöglicht.
- Lassen Sie die unter Hitzeschock stehenden Tiere 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln ruhen und brüten Sie die Platten dann über Nacht im Dunkeln bei 25 °C aus.
- Untersuchen Sie mit einem Standard-Stereomikroskop, das mit einer Fluoreszenzlichtquelle gekoppelt ist, die Tiere unter dem grün fluoreszierenden Protein (GFP)-Filter auf gcy-5prom::gfp-abgeleitete Signale im mittleren Körperbereich der Würmer, wie in Abbildung 2 gezeigt. Set-Mikroskop für GFP-Signale: Anregungsmaximum bei 488 nm mit Emissionsmaximum bei 509 nm.
- Bewerten Sie den Grad der Umwandlung von Keimzellen in Neuronen, indem Sie Tiere mit GFP-Signalen im mittleren Körperbereich auf Agarpad-haltige Mikroskopieobjektträger montieren.
- Zählen Sie die Anzahl der Tiere, die die Umwandlung von Keimzellen in Neuronen zeigen, im Vergleich zu den dunklen Tieren, um die Penetranz des Phänotyps zu beurteilen. Typischerweise zeigen etwa 30 % der Tiere diskrete GFP-Signale in der Keimbahn nach einer Verarmung von lin-53, während nicht mehr als 5 % der Tiere diffuse GFP-Signale in der Keimbahn bei leerer Vektor-RNAi zeigen.
