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Haftungsausschluss: Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Mechanische Homogenisierung des Gehirns und des Rückenmarks
HINWEIS: Die in diesem Abschnitt beschriebenen Volumina reichen für die Homogenisierung der Hälfte des Gehirns oder des Rückenmarks aus.
- Kühlen Sie den Glasmörser der Dounce Tissue-Mühle (Table of Materials) auf Eis vor.
- Geben Sie 3 ml vorgekühlte 1x Hank's ausgewogene Salzlösung (HBSS) in den Mörser.
- Übertragen Sie das Gewebe (Gehirn oder Rückenmark) aus der Vertiefung der 6-Well-Platte in den Glasmörser, wobei Sie darauf achten, dass es in 1x HBSS getaucht ist und am Boden des Mörsers sitzt.
- Zerkleinern Sie das Gewebe vorsichtig mit 10 Stößeln A, gefolgt von 10 Stößeln B. Übertragen Sie die homogenisierte Mischung in ein neues konisches 15-ml-Röhrchen.
- Füllen Sie das Röhrchen mit vorgekühltem 1x HBSS auf ein Endvolumen von 10 mL und zentrifugieren Sie es 10 min lang bei 320 x g bei 4 °C.
- Saugen Sie den Überstand an und geben Sie eiskaltes 1x HBSS in jedes Röhrchen bis zu einem Endvolumen von 7 mL und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig durch Vortexen.
>2. Beseitigung von Schutt
HINWEIS: Die Entfernung von Ablagerungen, die hauptsächlich aus unverdautem Gewebe und Myelinscheiden bestehen, ist ein kritischer Schritt, um eine effiziente Färbung des Gewebehomogenats für nachfolgende durchflusszytometrische Analysen zu ermöglichen.
- Filtrieren Sie jede Probe durch ein 70-μm-Zellsieb, um unverdaute Gewebestücke zu entfernen. Dieser Schritt ist besonders wichtig bei der Arbeit mit Rückenmarksgewebe, da diese Proben mit größerer Wahrscheinlichkeit unverdaute Nervenfragmente oder Hirnhäute enthalten, die die nachfolgenden Schritte beeinträchtigen könnten.
- Stellen Sie sicher, dass das endgültige Volumen in jedem Probenröhrchen 7 mL beträgt. Wenn nicht, mit eiskaltem 1x HBSS bis zu 7 mL auffüllen.
- Geben Sie 3 ml vorgekühlte isotonische Percoll-Lösung (IPS) zu jeder Probe, um ein Endvolumen von 10 ml einer Lösung herzustellen, die Dichtegradientenmedium in einer Endkonzentration von 30 % enthält. Wirbeln Sie die Proben vorsichtig durch, um sicherzustellen, dass sie homogen gemischt werden.
- Zentrifugieren Sie die Proben 15 min lang bei 700 x g bei 18 °C und stellen Sie darauf hin, dass die Beschleunigung der Zentrifuge auf 7 und die Bremse auf 0,
Anmerkung: Die Zentrifugation sollte ca. 30 Minuten dauern.
- Entnehmen Sie die Proben vorsichtig aus der Zentrifuge.
Anmerkung: Eine weißliche Scheibe, die aus Ablagerungen und Myelin besteht, sollte auf der Oberfläche der Lösung schwimmend zu sehen sein. Ein Pellet (mit den gewünschten Zellen) sollte am Boden des Röhrchens sichtbar sein.
- Saugen Sie vorsichtig die gesamte weißliche Scheibe mit Schmutz und dann den Rest des Überstands ab und achten Sie darauf, dass sich das Pellet nicht löst. Lassen Sie etwa 100 μl Lösung auf dem Zellpellet, um das Risiko eines versehentlichen Lösens zu vermeiden.
- Geben Sie 1 ml Durchflusszytometrie (FACS) Blockierungslösung (BL) hinzu, resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie es mit einer 1000-μl-Pipettenspitze auf und ab pipettieren und die Proben in 1,5-ml-Röhrchen überführen.
- 5 min bei 450 x g bei Raumtemperatur (RT) zentrifugieren.
- Der Überstand wird vorsichtig abgesaugt und das Pellet in dem geeigneten Puffer resuspendiert, der mit nachgeschalteten Analysen kompatibel ist