$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle Verfahren mit Tiermodellen wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE Veterinärprüfungsausschuss überprüft.
>1. Vorbereitung der Materialien
- MACS-Puffer (Magnetic-activated cell sorting): Bereiten Sie 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) (Materialtabelle) in PBS-/- vor.
- Kollagenase IV-Stammlösung (20 U/μl): Resuspendieren Sie das Pulver in PBS+/+ (Materialtabelle), aliquot und lagern Sie es bei -20 °C.
Anmerkung: Kollagenase IV benötigt MgCl2, um voll aktiv zu sein; Frieren und tauen Sie die Kollagenase IV-Lösung nicht ein.
- Anästhesie-Analgetikum-Lösung: Mischen Sie 150 μl Ketamin (150 mg/kg), 25 μl Xylazin (5 mg/kg) und 330 μl Buprecare (0,1 mg/kg) in 1 ml PBS-/-.
Anmerkung: Bereiten Sie die Anästhesie-Analgetika-Lösung aus dem Stegreif vor und bewahren Sie sie nicht länger als einen Tag auf.
- Heparinlösung (100 U/ml): Resuspendieren Sie das Pulver in PBS-/-.
- Bereiten Sie das Infusionseinschubsystem vor, indem Sie einen Schlauch mit einer mit PBS-/- gefüllten Karaffe Erlenmeyer verbinden. Verbinden Sie eine 23-G-Nadel mit dem Ende des Infusionsschlauchs. Öffnen Sie den Infusionseinsatz und lassen Sie das PBS laufen, bis sich keine Blasen mehr im Schlauch befinden.
- Bereiten Sie die mit einer Lampe ausgestattete Binokularlupe vor.
>2. Haltung von C57BL/6 Mäusen
- Für die Analyse von CP (Plexus choroideus), myeloischen oder T-Zellen verwenden Sie jeweils vier Mäuse und poolen Sie die vier CP (zwei aus jedem lateralen Ventrikel, dem dritten Ventrikel und dem vierten Ventrikel-CP; für insgesamt acht Mäuse). Wenn CP nicht gepoolt wird, besteht das Risiko, dass die seltenen Immunpopulationen bei CP aufgrund ihrer geringen Abundanz nicht nachgewiesen werden können.
- Lassen Sie die Mäuse mindestens 7 Tage lang akklimatisieren, bevor Sie mit dem Versuch beginnen. Halten Sie die Mäuse unter erregerfreien Bedingungen bei konstanter Temperatur und Luftfeuchtigkeit, in einem 12/12 h oder 14/10 h Hell-Dunkel-Zyklus, mit Wasser und handelsüblichem Pelletfutter ad libitum.
>3. PBS-Perfusion und Hirndissektion
- Wiegen Sie jede Maus und injizieren Sie 10 μl/g der Anästhesie-Analgetikum-Mischlösung (Schritt 1.3) intraperitoneal.
- Warten Sie etwa 30 Minuten auf eine wirksame Analgesie (überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Finger der Maus zusammendrücken).
- Positionieren Sie die betäubte Maus flach auf dem Rücken auf der Präparierstütze und kleben Sie ihre Handflächen an die Präparierstütze.
- Kneifen Sie die Haut des Tieres mit einer Pinzette und einer Schere und öffnen Sie den Bauch, das Zwerchfell und den Brustkorb, um das Herz freizulegen.
Anmerkung: Wenn der Thorax geöffnet wird, wird das Gehirn anoxisch. Man muss die nächsten Schritte der Perfusion präzise und schnell durchlaufen.
- Injizieren Sie 20 μl 100 U/ml Heparinlösung direkt in den linken Ventrikel.
- Machen Sie mit einer feinen Schere einen Schnitt von mindestens 3 mm in den rechten Vorhof, damit das Blut aus dem Körper abfließen kann.
- Führen Sie unmittelbar danach die 23-G-Nadel, die am Ende des Infusionsschlauchs platziert ist, durch die Spitze des linken Ventrikels ein.
- Öffnen Sie das Infusionssystem maximal und warten Sie auf die vollständige Perfusion: Mit einer 23 G Nadel bei einer Flussrate von ca. 6 mL/min ist die Perfusion in 3 min.
Anmerkung: Die gleichmäßige Verfärbung von Organen wie der Leber zeugt von der Wirksamkeit der Durchblutung.
- Schließen Sie das Infusionssystem und entfernen Sie die Nadel aus der Herzkammer.
- Entfernen Sie das Klebeband von den Handflächen der Maus. Platzieren Sie die Maus in einer ventralen Position.
- Kneifen Sie die Haut des Tieres mit einer Zange und einer Schere und entfernen Sie die Haut vom Scheitel des Kopfes, von den Augen bis zu den Ohren.
- Schneiden Sie mit Hilfe einer Schere den Schädel zuerst zwischen den Augen und dann seitlich von jedem Auge bis zum Rückenmark knapp über den Kaumuskeln. Verwenden Sie dazu das Ende einer Schere und gehen Sie vorsichtig vor, um das Gehirn mit der Schere nicht zu schädigen.
- Öffne den Schädel mit einer Pinzette, indem du ihn von den Extremitäten zwischen den Augen einklemmst.
- Schneiden Sie mit einer Schere das Rückenmark durch und ziehen Sie das Gehirn mit einer Zange heraus, indem Sie ihre beiden Punkte auf der lateralen Seite des Gehirns platzieren, um es zu kippen und in eine Petrischale zu legen, die mit eiskaltem PBS+/+ gefüllt ist. Die CPs werden dann sofort eingesammelt.
Anmerkung: Überprüfen Sie das Gehirn auf Verfärbungen, um die Wirksamkeit der Perfusion zu überprüfen.
>4. Dissektion des Plexus choroideus aus dem Gehirn
- Positionieren Sie die Rückenseite des Gehirns nach oben in der Petrischale und unterhalb der Objektive der Binokularlupen.
- Führen Sie mit Hilfe einer Pinzette, um das Gehirn an Ort und Stelle zu halten, die beiden Enden einer anderen Pinzette durch die Mittellinie zwischen den Hemisphären nach unten.
- Ziehen Sie mit der Pinzette den Kortex mit dem Kallosum und dem Hippocampus vom Septum weg, wodurch der laterale Ventrikel und ein Teil des dritten Ventrikels freigelegt werden.
- Identifizieren Sie die laterale CP als einen langen Schleier, der den lateralen Ventrikel auskleidet und an beiden Enden aufbläht. Benutze die beiden Enden einer dünnen Pinzette, um die laterale CP zu fangen. Achte darauf, den dreieckigen hinteren Teil zu sammeln, der möglicherweise von der hinteren Falte des Hippocampus verdeckt wird.
- Ziehen Sie den Kortex, das Corpus callosum und den Hippocampus der kontralateralen Hemisphäre vom Septum weg, um den gesamten dritten Ventrikel und den gegenüberliegenden lateralen Ventrikel freizulegen.
- Sammeln Sie die dritte CP mit einer feinen Pinzette, die als kurze Struktur mit körniger Oberflächenausrichtung zu erkennen ist.
- Sammle den anderen seitlichen CP ein.
- Führen Sie die beiden Enden einer Pinzette zwischen Kleinhirn und Mittelhirn ein. Löse das Kleinhirn von den Pons und der Medulla, um den vierten Ventrikel freizulegen.
- Identifizieren Sie den vierten CP als eine lange kugelförmige Struktur mit einem körnigen Oberflächenaspekt, der den vierten Ventrikel vom lateralen rechten Ende bis zum linken Ende zwischen dem Kleinhirn und der Medulla auskleidet. Den vierten CP mit einer feinen Pinzette einsammeln.
Anmerkung: Die Silan-Basisbeschichtung der Pinzette kann die Klebrigkeit von CP an der Pinzette verhindern.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1 bis 4.9 für jede der anderen sieben Mäuse. In der Zwischenzeit kann der gesammelte CP vorübergehend in einer auf Eis gestellten Röhre aufbewahrt werden.
>5. Vorbereitung von Proben für die Durchflusszytometrie-Analyse
- Füllen Sie das Röhrchen mit dem gesamten präparierten CP auf 750 μl PBS+/+.
Anmerkung: Die Abscheidung von präpariertem CP mit einer dünnen Pinzette im Röhrchen erzeugt ein kleines Volumen an PBS+/+. Um einen möglichen Verlust des CP-Gewebes zu vermeiden, ist es besser, das vorhandene Volumen auf 750 μL zu vervollständigen, als es zu entfernen und durch frische 750 μL PBS+/+ zu ersetzen.
- 15 μl 20 μl Kollagenase-IV-Stammlösung (siehe Schritt 1.2) für eine Endkonzentration von 400 μl/ml.
Anmerkung: DNAse I (150 μg/ml) kann eine übermäßige Zellverklumpung verhindern.
- Inkubieren Sie CP mit Kollagenase IV bei 37 °C unter leichtem Rühren (300 U/min) für 45 Minuten.
- Pipettieren Sie etwa 10 Mal vorsichtig auf und ab, um die CP-Dissoziation abzuschließen.
- Füllen Sie das CP-Röhrchen auf 1,5 mL mit MACS-Puffer (siehe Rezeptschritt 1.1), um die Kollagenase-IV-Aktivität zu stoppen.
Anmerkung: Die Kollagenase IV-Aktivität wird bei niedrigen Temperaturen gestoppt und durch Serumalbumin gehemmt.
- Die Zellen werden bei 500 x g 5 min lang bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und die Zellen werden mit 1,5 mL MACS-Puffer gewaschen.
- Die Zellen werden 5 Minuten lang bei 500 x g und 4 ΰC zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und die Zellen werden in 220 μl MACS-Puffer resuspendiert.