Gewinnung einer gemischten Gliazellkultur aus einem neonatalen Mausgehirn

Zusammenfassung

Quelle: Sarkar, S. et al., Schnelle und verfeinerte CD11b-Magnetisolierung von primären Mikroglia mit verbesserter Reinheit und Vielseitigkeit. J. Vis. Exp. (2017)

Das Video demonstrierte die Methode zur Isolierung und Kultivierung von Zellen aus einem neugeborenen Mäusegehirn. Es beinhaltete die enzymatische und mechanische Dissoziation des Gehirns, gefolgt von der Kultivierung in Wachstumsmedien ohne neuronalen Wachstumsfaktor, um eine gemischte Gliapopulation zu erhalten.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.

>1. Wachstum von gemischten Gliakulturen

1. Enthaupten Sie 1- bis 2 Tage alte Welpen schnell mit einer 5,5-Zoll-Schere und legen Sie die Köpfe sofort in ein 50-ml-Röhrchen auf Eis. Beachten Sie, dass diese Enthauptung die Art der Euthanasie ist.
2. Machen Sie in einer Laminar-Airflow-Haube mit einer geraden 4,5-Zoll-Mikropräparierschere einen kleinen Schnitt in den Schädel und die Hirnhäute. Beginnen Sie mit dem Schneiden vom kaudalen Ende bis zum rostralen Ende (Nase). Gelangen Sie unter die Haut, indem Sie die durch die Enthauptung entstandene Öffnung nutzen.
   1. Nach dem Schnitt schälen Sie eine der Halbkugeln zur Seite. Verwenden Sie dann eine gebogene oder hakenförmige Pinzette, um das gesamte Gehirn zu entfernen.
3. Tauchen Sie das/die Gehirn(e) in ein neues 50-ml-Röhrchen mit 0,25 % Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) für 15 Minuten in ein 37 °C heißes Wasserbad. Verwenden Sie 2 ml Trypsin-EDTA pro Gehirn.
4. Waschen Sie das/die Gehirn(e) mit frischen Wachstumsmedien (10% fötales Rinderserum (FBS), Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nährstoffmischung F12 (DMEM/F12), 1% Penicillin/Streptomycin, 1% L-Glutamin, 1% Natriumpyruvat und 1% nicht-essentielle Aminosäuren), indem Sie das Medium hinzufügen und entfernen. Wiederholen Sie dies 4x.
5. Für jedes Gehirn werden zwei T-75-Kolben mit Wachstumsmedien bestückt. Geben Sie daher 2 ml Wachstumsmedium pro Gehirn in das Röhrchen. Somit entspricht es 1 ml homogenisiertem Gehirn mit 8-9 ml Wachstumsmedium pro T-75-Kolben.
6. Homogenisieren Sie, indem Sie das/die Gehirn(e) mit Pipetten unterschiedlicher Öffnungsgröße verreiben, in der Reihenfolge von der größten zur kleinsten. Wenn sichtbar ist, dass das Hirngewebe nicht kleiner wird, gehen Sie zur nächsten Pipette über. Am Ende der Verreibung sollte die Suspension klar sein und keine sichtbaren Stücke aufweisen.
   1. Verwenden Sie nacheinander eine 25-ml-Pipette, eine 5-ml-Pipette und dann eine 10-ml-Pipette.
7. Jede homogene Gehirnsuspension wird durch ein 70-μm-Zellsieb geleitet, um sie zu einer einzelnen Zellkultur zu machen.
8. Für jedes homogenisierte Gehirn sind zwei T-75-Kolben mit Wachstumsmedien zu plattieren, wie in Schritt 1.5 beschrieben (1 ml homogenisiertes Gehirn mit 8-9 ml Wachstumsmedium pro T-75-Kolben).
9. Wechseln Sie das Wachstumsmedium nach 6 Tagen und wachsen Sie bis zur Isolation am 16. Tag.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM/F12 (1:1) (1x)	Lebenstechnologien	11330057
Natriumpyruvat	Lebenstechnologien	11360070
MEM Nicht-essentielle Aminosäuren (100x)	Lebenstechnologien	11140050
L-Glutamin (100x)	Lebenstechnologien	25030081
Edta	Fisher Scientific	AM9260G
Fötales Rinderserum	Sigma	Nr. 13H469
0,25 % Trypsin-EDTA	Gibco von Life Technologies	Artikel-Nr.: 25200