Differenzierung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen in Mikroglia-ähnliche Zellen

Zusammenfassung

Quelle: Funes, S. et al., Humane Mikroglia-ähnliche Zellen: Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen und In-vitro-Phagozytose-Assay für lebende Zellen unter Verwendung humaner Synaptosomen.J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video zeigt den Ablauf der Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Mikroglia-ähnliche Zellen. Der Prozess umfasst die Bildung von Embryoidkörpern, deren Überführung in beschichtete Vertiefungen und die Verwendung spezifischer Wachstumsfaktoren, um die Differenzierung in primitive Makrophagen-Vorläufer zu steuern, die sich schließlich zu Mikroglia-ähnlichen Zellen differenzieren.

Protokoll

>1. Differenzierung von Mikroglia

HINWEIS: Eine Übersicht über das Protokoll ist in Abbildung 1 zusammengefasst.

1. Kultur aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs)
   Anmerkung: Weitere Einzelheiten zur Beschreibung der iPS-Kulturtechniken finden Sie an anderer Stelle.
   1. Auftauen und Wartung
      1. Bereiten Sie das iPSC-Medium vor, aliquotieren Sie es und lagern Sie es bis zu 6 Monate bei -20 °C. Tauen Sie die Aliquots über Nacht bei 4 °C auf und verwenden Sie sie bis zu 1 Woche lang. Lassen Sie das Medium vor Gebrauch mindestens 1 h be....

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Protokolls zur Differenzierung von iPSCs in Mikroglia-ähnliche Zellen.Am Tag 0, sobald die iPSCs eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, werden die Kolonien in Einzelzellen dissoziiert und in EB-Medium kultiviert, um die EB-Bildung zu induzieren. An Tag 4 werden EBs gesammelt und in PMP-Medium plattiert, um die PMP-Bildung zu induzieren. Nach 28 Tagen w.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Materialien für die Zellkultur
6-Well-Platten	Greiner Bio-One	Artikel-Nr.: 657160
100 mm x 20 mm Gewebekultur behandelt	CELLTREAT	Artikel-Nr.: 229620
Zellheber, doppelend, flache Klinge und schmale Klinge, steril	CELLTREAT	229305
96-Well-Platte mit rundem Boden und geringer Adhärenz	Corning	7007
Primaria 24-Well-Multiwell-Zellkulturplatte mit flachem Boden und modifizierter Oberfläche	Corning	353847,
Primaria 6-Well-Zell-Clear-Multiwell-Multiwell-Kulturplatte mit flachem Boden	Corning	353846
Primaria 96-Well-Mikroplatte mit klarem Flachboden	Corning	353872
Reagenzien für die Zelldissoziation
Accutase	Corning	25058CI	Dissoziationsreagenzien, die für die Differenzierung von unteren Motoneuronen verwendet werden
TrypLE Reagenz	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 12-605-010	Dissoziationsreagenzien, die für die Differenzierung von Mikroglia verwendet werden
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0	Invitrogen	15575020
Beschichtungsreagenzien für die Zellkultur
Matrigel GFR-Membran-Matrix	Corning™	Artikel-Nr.: 354230	Bezeichnet als extrazelluläres Matrix-Beschichtungsreagenz
CellAttach Laminin-521	STEMCELL-Technologie	77004	Bezieht sich auf Laminin 521
Poly-D-Lysin	Sigma	Nr. P7405	Rekonstitution zu 0,1 mg/ml in Boratpuffer
Poly-L-Ornithin	Sigma	Nr. P3655	Rekonstitution zu 1 mg/ml in Boratpuffer
Komponenten von iPSC-Medien
mTeSR Plus Bausatz	STEMCELL-Technologie	Tel.: 100-0276	Zur Vorbereitung von iPSC-Medien wurden die Komponenten auf 1x gemischt
Bestandteile von EB media
BMP-4	Fisher Scientific	PHC9534	Endkonzentration 50 ng/mL
iPSC-Medien			Endkonzentration 1x
ROCK-Inhibitor Y27632	Fisher Scientific	BD 562822	Endkonzentration 10 μM
Scf	PeproTech	Nr. 300-07	Endkonzentration 20 ng/mL
VEGF	PeproTech	100-20A	Endkonzentration 50 ng/mL
Bestandteile von PMP-Basismedien
GlutaMAX	Gibco	35050061	Endkonzentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Gibco	15140122	Endkonzentration 100 U/mL
X-VIVO 15	Lonza	Tel.: 12001-988	Endkonzentration 1x
Komponenten von PMP complete media
55 mM 2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	Endkonzentration 55 μM
IL-3	PeproTech	Nr. 200-03	Endkonzentration 25 ng/mL
M-CSF	PeproTech	300-25	Endkonzentration 100 ng/mL
PMP-Basismedien			Endkonzentration 1x
Bestandteile der iMG Basismedien
Erweitertes DMEM/F12	Gibco	12634010	Endkonzentration 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	Endkonzentration 1x
N2 Zuschlag, 100x	Gibco	Artikel-Nr.: 17502-048	Endkonzentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Gibco	15140122	Endkonzentration 100 U/mL
Komponenten von iMG complete media
55 mM 2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	Endkonzentration 55 μM
IL-34	PeproTech oder Biologend	200-34 oder 577904	Endkonzentration 100 ng/mL
iMG Basismedien			Endkonzentration 1x
M-CSF	PeproTech	300-25	Endkonzentration 5 ng/mL
TGF-β	PeproTech	100-21	Endkonzentration 50 ng/mL
Bestandteile von Induktionsbasismedien
DMEM/F12 mit HEPES	Gibco	11330032	Endkonzentration 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	Endkonzentration 1x
N2 Zuschlag, 100x	Gibco	Artikel-Nr.: 17502-048	Endkonzentration 1x
Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA), 100x	Gibco	11140050	Endkonzentration 1x
Komponenten von kompletten Induktionsmedien
Verbindung E	Calbiochem	Artikel-Nr.: 565790	Endkonzentration 0,2 μM und Rekonstitution des Stammreagenzes auf 2 mM in 1:1 Ethanol und DMSO
doxycyclin	Sigma	Nr. D9891	Endkonzentration 2 μg/mL und Rekonstitution des Stammreagenzes auf 2 mg/mL in DPBS
Induktions-Basismedien			Endkonzentration 1x
ROCK-Inhibitor Y27632	Fisher Scientific	BD 562822	Endkonzentration 10 μM
Andere Zellkulturreagenzien
Trypanblau, 0,4 % Lösung	AMRESCO INC	K940-100ML
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma	Artikel-Nr.: 22144-77-0
DPBS mit Calcium und Magnesium	Corning	21-030-CV
DPBS ohne Calcium und Magnesium	Corning	21-031-CV	Bezieht sich auf DPBS
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	Bezeichnet als DMEM-F12, optimiert für das Wachstum von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen
Laminin Mausprotein, natürlich	Gibco	23017015	Bezieht sich auf Laminin