>1. Differenzierung von Mikroglia
HINWEIS: Eine Übersicht über das Protokoll ist in Abbildung 1 zusammengefasst.
- Kultur aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs)
Anmerkung: Weitere Einzelheiten zur Beschreibung der iPS-Kulturtechniken finden Sie an anderer Stelle.
- Auftauen und Wartung
- Bereiten Sie das iPSC-Medium vor, aliquotieren Sie es und lagern Sie es bis zu 6 Monate bei -20 °C. Tauen Sie die Aliquots über Nacht bei 4 °C auf und verwenden Sie sie bis zu 1 Woche lang. Lassen Sie das Medium vor Gebrauch mindestens 1 h bei Raumtemperatur.
- Beschichten Sie die Vertiefungen einer 6-Well-Platte durch Zugabe von 1 ml 10 μg/ml Laminin 521, verdünnt in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS), die Calcium und Magnesium enthält. Bewahren Sie die Platten in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 für mindestens 2 h oder vorzugsweise über Nacht auf. Nach der Verdünnung das Laminin 3 Monate bei 4 °C lagern.
- 10 mM Rho-Kinase-Inhibitor Y27632 (ROCK-Inhibitor) Stammlösung durch Verdünnung in sterilem Wasser herstellen. Stellen Sie Einmalaliquote aus ROCK-Inhibitorlösung her und lagern Sie sie bis zu 1 Jahr lang bei -20 °C.
- Bereiten Sie 0,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) vor, indem Sie die Stammlösung von 0,5 M EDTA in DPBS verdünnen.
- Um eine Durchstechflasche mit gefrorenen iPS-Zellen aufzutauen, stellen Sie die Durchstechflasche in ein Wasserbad bei 37 °C, bis sie größtenteils aufgetaut ist. Übertragen Sie den Inhalt der Durchstechflasche sofort in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 4 ml iPSC-Medium. Bei 500 × g 1 min zentrifugieren.
- Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie langsam 1 ml iPSC-Medium mit 10 μM ROCK-Inhibitor gegen die Wand des Röhrchens geben, um eine Störung der Kolonien zu vermeiden.
- Geben Sie 1,5 ml iPSC-Medium mit 10 μM ROCK-Inhibitor in jede der beschichteten Vertiefungen und übertragen Sie die resuspendierten Kolonien Tropfen für Tropfen in die Vertiefungen, die das Medium enthalten.
Anmerkung: Verwenden Sie 5-7 Tropfen aus Schritt 1.1.1.6 für die Kulturerhaltung, aber passen Sie die optimale Aussaatdichte für jede iPSC-Linie an.
- Verteilen Sie die Zellen gleichmäßig in den Wells, indem Sie die Platte manuell von einer Seite zur anderen und von hinten nach vorne mischen. Legen Sie die Zellen in einen Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2. Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag vollständig durch Zugabe von frischem iPSC-Medium ohne ROCK-Inhibitor.
- Zur Aufrechterhaltung wechseln Sie das Medium täglich, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreichen.
Anmerkung: Die Zellen können ohne Wechsel des Mediums für 2 Tage aufbewahrt werden, wenn das verwendete iPSC-Medium einen flexiblen Fütterungsplan ermöglicht. Es wird empfohlen, dies auf einmal pro Passage zu beschränken und nur dann, wenn die Zellen zu weniger als 50 % konfluiert sind.
- Spaltung
- Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 1 ml DPBS (ohne Kalzium und Magnesium).
- Um die Zellen zu entfernen, fügen Sie 1 ml 0,5 mM EDTA hinzu und inkubieren Sie 2-3 Minuten bei Raumtemperatur, bis sich die Ränder der Zellkolonien von der Oberfläche der Vertiefung abheben. Waschen Sie die Zellen erneut mit DPBS und fügen Sie 1 ml iPSC-Medium hinzu.
- Dissoziieren Sie die Zellkolonien, indem Sie sie vorsichtig mit einem Zellheber abkratzen. Kratzen Sie jeden Bereich des Brunnens nur einmal ab, um die Kolonien nicht zu stören.
Anmerkung: Alternative Methoden, um die Völker aus dem Brunnen zu entfernen, finden sich an anderer Stelle.
- Entnehmen Sie die Zellen mit einer 1-ml-Pipettenspitze und übertragen Sie sie Tropfen für Tropfen im Verhältnis 1:6 (Zellen zu Medium) in vorbeschichtete Vertiefungen (wie in Schritt 1.1.1.2 erwähnt), die 1,5 ml iPSC-Medium enthalten.
>2. iPSC-Differenzierung zu Mikroglia-ähnlichen Zellen (iMGs)
HINWEIS: Die kleinen Moleküle und Wachstumsfaktoren werden in sterilfiltriertem 0,1%igem Rinderserumalbumin in DPBS auf eine Stammkonzentration gelöst, die 1.000x höher ist als die Endkonzentration. Es wird empfohlen, iPSCs in frühen Passagen in iMGs zu unterscheiden. Eine routinemäßige Karyotypisierung von iPS-Linien wird empfohlen.
- Bereiten Sie die Standard-Beschichtungslösung vor
- Tauen Sie die Stammlösung eines extrazellulären Matrix-Beschichtungsreagenzes über Nacht bei 4 °C auf Eis auf.
- Mikrozentrifugenröhrchen und Filterpipettenspitzen bei 4 °C vorkühlen.
- Aliquotieren Sie 250 μl des konzentrierten extrazellulären Matrix-Beschichtungsreagenzes in jedes Röhrchen und legen Sie es sofort auf Eis. Die Aliquote bei -20 °C lagern.
- Zur Herstellung der Beschichtungslösung wird eines der Aliquote des extrazellulären Matrix-Beschichtungsreagenzes über Nacht bei 4 °C auf Eis aufgetaut.
- Geben Sie 50 mL eiskaltes Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient mixture F12 (DMEM-F12), optimiert für das Wachstum von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen (bezeichnet als DMEM-F12) Medien in ein vorgekühltes konisches Röhrchen und halten Sie es auf Eis.
- Kühlen Sie eine 1-ml-Pipettenspitze, indem Sie eiskaltes DMEM-F12 mehrmals auf und ab pipettieren und dann sofort mit der Pipettenspitze 250 μl des extrazellulären Matrix-Beschichtungsreagenzes in das konische Röhrchen mit dem DMEM-F12-Medium überführen.
Anmerkung: Die Standard-Beschichtungslösung kann 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
- Bildung des Embryoidkörpers (EB)
- Bereiten Sie EB-Medium vor, das bis zu 4 Tage lang bei 4 °C gehalten werden kann.
- Sobald die iPS-Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, dissoziieren Sie die Kolonien, indem Sie sie mit 1 ml DPBS waschen und 1 ml eines Dissoziationsreagenzes für 2 Minuten bei 37 °C hinzufügen. Lösen Sie die Kolonien mit einem Zelllifter, indem Sie mehrmals kratzen, um eine einzellige Suspension zu erzeugen. Sammeln Sie die Zellen und geben Sie alles in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 9 mL DPBS.
- Zentrifugieren Sie die Zellen 1 Minute lang bei 500 × g, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml EB-Medium. Nehmen Sie 10 μl Zellen und verdünnen Sie sie 1:1 mit Trypanblau. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämazytometer und verdünnen Sie den Zellbestand auf der Grundlage der Zellzahl auf eine endgültige Verdünnung von 10.000 Zellen pro 100 μl. Für die Beschichtung von Zellen geben Sie 100 μl der verdünnten Zellen pro Vertiefung in eine 96-Well-Platte mit rundem Boden und geringer Adhärenz.
Anmerkung: Im Allgemeinen können 48 Vertiefungen der 96-Well-Platte aus jeder 80%igen konfluenten Vertiefung von iPSCs gewonnen werden.
- Die Platte wird 3 Minuten lang bei 125 × g zentrifugiert und 4 Tage lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Führen Sie an Tag 2 einen halben Mediumwechsel durch, indem Sie mit einer Mehrkanalpipette vorsichtig 50 μl altes Medium auffangen und dann 50 μl frisches EB-Medium wieder hinzufügen.
Anmerkung: An Tag 4 bilden iPSCs kugelförmige zelluläre Strukturen, die als EBs bezeichnet werden, wie im Abschnitt über die Ergebnisse beschrieben. Der EB-Differenzierungsprozess kann bei Bedarf auf bis zu 7 Tage verlängert werden.
- Generierung von primitiven Makrophagen-Vorläufern (PMPs)
- Bereiten Sie das PMP-Basismedium und den Sterilfilter vor und lagern Sie es bis zu 1 Monat bei 4 °C.
- Die Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit 1 ml eiskalter Matrigel-Beschichtungslösung beschichten und bei 37 °C und 5 % CO2 mindestens 2 h oder vorzugsweise über Nacht inkubieren.
- Am Tag 4 der EB-Differenzierung übertragen Sie die EBs in die Matrigel-beschichteten Wells, indem Sie die EBs mit 1-ml-Pipettenspitzen (mit einer Pipette) sammeln. Pipettieren Sie ein- bis zweimal auf und ab, um die EBs aus der Vertiefung zu lösen. Halten Sie die 6-Well-Platte in einem geneigten Winkel, damit sich die EBs am Rand der Vertiefung absetzen können.
Anmerkung: Pro beschichteter Vertiefung können neun oder zehn EBs plattiert werden.
- Sobald sich alle EBs gesetzt haben, pipettieren Sie vorsichtig und entfernen Sie das alte Medium mit einer 1-ml-Pipettenspitze, während Sie die EBs am Rand der Vertiefung belassen. Geben Sie 3 ml frisch zubereitetes PMP Complete Medium in jede Vertiefung. Verteilen Sie die Zellen gleichmäßig in den Wells, indem Sie die Platte manuell von einer Seite zur anderen und von hinten nach vorne mischen. Stellen Sie die Platte bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator.
- Stören Sie die Platte 7 Tage lang nicht, damit sich die EBs am Boden der Vertiefung befestigen können. Führen Sie nach dieser Zeit einen halben Mediumwechsel mit PMP complete medium durch.
Anmerkung: Zu diesem Zeitpunkt sollten die meisten EBs an der Platte befestigt werden. Potentialfreie EBs können entfernt werden.
- Untersuchen Sie die EBs nach 5-7 Tagen unter einem Lichtfeldmikroskop bei 4-facher Vergrößerung, um sicherzustellen, dass sie am Boden der Vertiefungen befestigt sind. Wechseln Sie das Medium, wie in 1.2.3.5 beschrieben. Führen Sie an Tag 21 einen vollständigen Medienwechsel mit 3 mL PMP vollständigem Medium durch.
Anmerkung: Myeloische Vorläuferzellen, die im Medium schwimmen, könnten an dieser Stelle offensichtlich sein. Diese Zellen sollten während des Mediumwechsels verworfen werden.
- Suchen Sie an Tag 28 im Überstand nach runden Zellen, die als PMPs bezeichnet werden, und entnehmen Sie das Medium, das die PMPs enthält, mit einer 10-ml-Pipette und einer automatischen Pipette. Achten Sie darauf, die EBs nicht zu stören. Übertragen Sie die PMPs und das Medium in ein konisches 15-ml-Röhrchen und gehen Sie wie in Schritt 1.2.4 beschrieben vor.
Anmerkung: In der Regel können PMPs aus derselben iPSC-Linie aus fünf Vertiefungen einer 6-Well-Platte entnommen und in einem einzigen konischen 15-ml-Röhrchen zusammengefasst werden.
- Fügen Sie 3 ml frisches PMP-Komplettmedium zur weiteren Pflege der EBs hinzu. Da PMPs länger als 3 Monate kontinuierlich aus EBs austreten, sammeln Sie sie alle 4-7 Tage (lassen Sie das Medium nicht in einen Gelbton wechseln), wie in den Schritten 1.2.3.7 und 1.2.3.8.
beschrieben
Anmerkung: Obwohl PMPs mehrere Monate lang gesammelt werden können, können sie ihren Phänotyp im Laufe der Zeit verändern.
- Abgrenzung zu iMGs
- Bereiten Sie das iMG-Basismedium (Materialtabelle) vor, filrieren Sie es steril und lagern Sie es bis zu 3 Wochen bei 4 °C.
- Nachdem die PMPs in einem konischen 15-ml-Röhrchen gesammelt wurden, zentrifugieren Sie sie 4 Minuten lang bei 200 × g. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die PMPs mit 1-2 mL iMG-Basalmedium. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer, indem Sie ein kleines Aliquot nehmen und 1:1 mit Trypanblau verdünnen.
HINWEIS: 0,5-1,5 × 106 PMPs werden normalerweise jede Woche in Abhängigkeit von der iPS-Linie und dem Alter der EB-Kultur erhalten.
- Zentrifugieren Sie den Rest der Zellen erneut bei 200 × g für 4 min. Verdünnen Sie die PMPs auf die gewünschte Konzentration, so dass die Zellen mit einer Dichte von ~105/cm2 auf mit Zellkulturen behandelten Platten mit frisch zubereitetem iMG-Komplettmedium plattiert werden. Führen Sie während 10-12 Tagen alle 3-4 Tage einen halben Wechsel des Mediums mit frisch zubereitetem iMG Complete-Medium durch, um eine terminale Differenzierung zu ermöglichen.
Anmerkung: Zu diesem Zeitpunkt sollten die Zellen eine Mikroglia-ähnliche Morphologie annehmen. Um die Bindung von PMPs an das Schicksal der Mikroglia zu bestätigen, wird eine Immunfluoreszenzanalyse durchgeführt, um die Expression von mit Mikroglia angereicherten Markern wie dem purinergen Rezeptor P2RY12 und dem Transmembranprotein 119 (TMEM119) zu bestätigen.
- Um die Gesundheit und Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten, führen Sie alle Experimente zwischen den Tagen 10 und 12 der iMG-Differenzierung durch.
