Etablierung einer Müller-Gliazellkultur aus der Netzhaut von Mäusen

Haftungsausschluss: Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

>1. Dissoziation der Netzhaut

HINWEIS: Alle folgenden Schritte (bis zur Zellernte) müssen in einer A2- oder B2-Biosicherheitswerkbank (BSC) durchgeführt werden.

1. Bereiten Sie die Papain/DNase I-Dissoziationsmischung wie folgt vor.
   1. Bei sechs Netzhäuten 75 μl DNase I in das Röhrchen mit 750 μl Papain geben und vorsichtig mischen (Dissoziationsmischung).
   2. Für die individuelle Probenvorbereitung, die für dieses Protokoll erforderlich ist, teilen Sie das Gesamtvolumen von 825 μl in drei Aliquots auf: 275 μl der Mischung in einem 1,5-ml-Röhrchen pro Maus (zwei Netzhäute). Berechnen Sie die benötigten Mengen an DNase I und Papain entsprechend.
      Anmerkung: Bis zu sechs Netzhäute können in einem Röhrchen mit Papain/DNase I-Gemisch dissoziiert werden. Die Vorbereitung einzelner Proben führt jedoch zu weniger Klumpen und einem besseren Zellwachstum als bei kombinierten Proben.
2. Übertragen Sie zwei Netzhäute auf das Papain/DNase I-Dissoziationsgemisch. Verwenden Sie eine Transferpipette mit einem vergrößerten Spitzendurchmesser, nehmen Sie die Netzhaut auf, warten Sie, bis sich die Netzhaut am unteren Ende der Spitze abgesetzt hat, und geben Sie dann die Netzhaut ohne übermäßige Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) in das Röhrchen mit dem Papain/DNase I-Gemisch ab.
3. Auf einen Nährstoffator legen und 10 min in einem Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5% CO₂) inkubieren.
4. Dissoziieren Sie die Zellen, indem Sie vorsichtig (ca. 20-30 Mal) mit einer 1-ml-Pipette auf und ab pipettieren. Nachdem die Zellen dissoziiert wurden (d. h. was zu einer homogenen Lösung ohne Stücke führt), fügen Sie 275 μl Ovomucoid-Proteasehemmer aus dem Papain-Dissoziationskit hinzu, um das Papain zu neutralisieren. Vorsichtig mischen, indem Sie auf und ab pipettieren. HINWEIS: Wenn sechs Netzhäute in 825 μl Papain/DNase I-Gemisch dissoziiert wurden, sind 825 μl Ovomucoid erforderlich.
5. Die Mischung bei 300 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
6. Geben Sie den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF, 1 μl pro 1 ml des Wachstumsmediums, rekonstituiert bei 200 μg/ml in PBS) zu dem berechneten Volumen des auf 37 °C vorgewärmten Wachstumsmediums (1 mL pro Maus).
   HINWEIS: Abhängig vom Versuchsdesign können zu Beginn der Kulturperiode der Proliferationsmarker 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin (EdU) sowie 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) oder andere erforderliche Faktoren hinzugefügt werden.
7. Nehmen Sie die Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge. Berühren Sie nicht das Pellet am Boden des Rohrs.
8. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und vollständig. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 500 μl EGF-supplementiertem Wachstumsmedium.
9. Übertragen Sie die Zellsuspension in eine Vertiefung der markierten 12-Well-Platte (Abbildung 1C). Spülen Sie das Röhrchen mit weiteren 500 μl des EGF-supplementierten Wachstumsmediums und geben Sie es in die Vertiefung (Gesamtvolumen von 1 mL pro Vertiefung).
10. Wiederholen Sie die Schritte 1.8 und 1.9 mit allen anderen Proben.
11. Schütteln Sie die Vertiefungsplatte dreimal vorsichtig (hin und her; links und rechts). Legen Sie die Platte in den Inkubator (37 °C, CO₂).
    Anmerkung: Wenn transgene Mäuse verwendet werden, ist für jedes Tier eine Genotypisierung durchzuführen (Abbildung 1D). Identifizieren Sie Cre-Rekombinase-positive und -negative Mäuse und beschriften Sie die Platte entsprechend. Für dieses Protokoll wurden nur Zellen von Cre-Rekombinase-positiven Reportermäusen für die nächsten Schritte verwendet. Zellen von Cre-negativen Proben werden eingefroren und für andere Anwendungen verwendet.

2. Wachstumsphase

HINWEIS: Die Wachstumsphase dauert ca. 4-5 Tage (Abbildung 2B). Um Flüssigkeiten in Vertiefungen mit Zellen zu geben, muss die Pipette auf die Wand der Vertiefung zeigen und die Flüssigkeit muss langsam freigesetzt werden, um eine Zellablösung zu vermeiden. Pipettieren Sie nicht direkt auf die Zellen.

1. Einen Tag nach der Dissoziation entfernen Sie das Medium und fügen Sie 1 ml frisches, mit EGF ergänztes Wachstumsmedium hinzu.
2. Entfernen Sie an Tag 3 das Medium und fügen Sie 1 ml HBSS (Raumtemperatur) hinzu, um Zelltrümmer zu entfernen. Schaukeln Sie sanft von links nach rechts hin und her. Entfernen Sie HBSS, wiederholen Sie den Waschschritt und fügen Sie 1 ml vorgewärmtes, mit EGF ergänztes Wachstumsmedium hinzu.
3. Überwachen Sie die Zellen jeden Tag und bewerten Sie ihren Wachstumsstatus, bis die Zellen eine Konfluenz von 90 % bis 100 % erreichen. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel für ein gutes MG-Wachstum im Laufe der Zeit. Auf mögliche Kontamination oder Zelltod prüfen. Kontaminierte Kulturen entsorgen.
   Anmerkung: Um den Zellzustand zu überwachen und aufzuzeichnen, nehmen Sie Bilder in verschiedenen Vergrößerungen mit einem Lichtmikroskop mit angeschlossener Kamera und 4x-, 10x- oder 20x-Objektiven auf. In dieser Studie wird ein Fluoreszenzmikroskop verwendet.

>3. Herstellung von Deckgläsern mit Poly-L-Ornithin (Poly-O) und Laminin-Schicht

HINWEIS: Dieser Schritt ist nur notwendig, wenn Immunfluoreszenzmarkierung und konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie durchgeführt werden. Für eine korrekte Bildgebung sind runde Glasdeckgläser (12 mm Durchmesser) erforderlich. Das Beschichtungsprotokoll finden Sie auch im Datenblatt des neuronalen Mediums (siehe Materialtabelle).

1. Platzieren Sie sterile Deckgläser vorsichtig in der Mitte jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte mit einer sterilen Dumont #2AP-Pinzette.
   Anmerkung: Legen Sie Deckgläser in die Mitte der Vertiefung. Das Anbringen von Deckgläsern in der Nähe der Wand eines Brunnens führt bei den folgenden Schritten zu Problemen mit der Oberflächenspannung.
2. Tauen Sie ein 2,5 mL Poly-O aliquot bei Raumtemperatur auf und geben Sie 100 μl davon in die Mitte jedes Deckglases.
3. Inkubieren Sie die Well-Platte für 30 min in einem 37 °C heißen Inkubator.
4. Entfernen Sie Poly-O und waschen Sie die Mulde mit dem Deckglas dreimal mit ~1 mL sterilem Wasser.
5. Lassen Sie die Well-Platte über Nacht im BSC trocknen. Tauen Sie 2,5 mL Laminin über Nacht bei 4 °C auf.
6. Am nächsten Morgen 100 μl Laminin in die Mitte jedes Deckglases geben und 4 h in einem 37 °C heißen Inkubator inkubieren.
7. Entfernen Sie das Laminin vorsichtig und vollständig.
8. Halten Sie die Platte bei 4 °C, wenn die Übergabe nicht sofort durchgeführt werden kann.
   Anmerkung: Die beschichteten Deckgläser in vorbereiteten Platten können einige Tage bei 4 °C aufbewahrt werden.

>4. Zellpassage zur Entfernung neuronaler Überlebender

HINWEIS: Die Zellpassage ist erforderlich, um neuronale Zellen zu entfernen, nicht um die Zellpopulation zu erhöhen. Gliazellen teilen sich nur wenige Male und wachsen nach der Passage nicht weiter. Zellsuspensionen nicht verdünnen. Die Zellen einer konfluenten Vertiefung einer 12-Well-Platte können auf eine Vertiefung einer 12-Well-Platte oder auf zwei Vertiefungen einer 24-Well-Platte verteilt werden. Bei der Verwendung von beschichteten Deckgläsern wird nur etwa ein Drittel des Deckglases beschichtet. Daher können sechs Deckgläser, die in einer 24-Well-Platte sitzen, mit konfluenten Zellen (~80%-90%) aus einer Welle konfluenter Zellen einer 12-Well-Platte gewonnen werden. Es können auch andere Verhältnisse gewählt werden, um die Zelldichte zu erhöhen oder zu verringern. Für dieses Protokoll wird eine Cre+-Reportermaus verwendet [ein Experiment, zwei Behandlungen: miR-25 oder control-miR; technische Replikate n = 3 (drei Deckgläser pro Behandlung), biologische Replikation n = 1]. Die Anzahl der technischen und biologischen Replikate kann je nach Versuchsdesign unterschiedlich definiert werden.

1. Prüfen Sie, ob die Zellen zu 90 % bis 100 % konfluent sind (auch am Rand der Vertiefung; Abbildung 3E,F).
2. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie 1 ml HBSS (Raumtemperatur) zum Waschen hinzu. Den Teller vorsichtig schaukeln (hin und her, links und rechts). Entfernen Sie HBSS vollständig.
3. Geben Sie 500 μl einer vorgewärmten trypsinhaltigen Lösung (vorgewärmt auf 37 °C in einem Metallperlenbad), um die Zellen aus der Vertiefung zu lösen. Sanft schaukeln (hin und her, von links nach rechts) und 2 min in einem 37 °C heißen Inkubator inkubieren.
4. Schieben Sie die Platte aus dem Inkubator in den BSC. Während des Kippens die trypsinhaltige Lösung aspirieren und mehrmals vorsichtig und langsam über die Vertiefung verteilen, bis sich die Zellen vollständig lösen. Halten Sie die Platte gegen das Licht und stellen Sie sicher, dass sich keine Zellen am Boden befinden.
5. Übertragen Sie diese Zellsuspension in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen. Bei 300 x g für 8 min bei 4 °C zentrifugieren.
6. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig, indem Sie 600 μl (100 μl pro Vertiefung für 6 Vertiefungen/Deckgläser) vorgewärmtes Wachstumsmedium (ergänzt mit EGF; 1:1000) hinzufügen und ~30-40 Mal auf und ab pipettieren.
   Anmerkung: Die Zellen können zu diesem Zeitpunkt bei -80 °C oder in flüssigem Stickstoff eingefroren und gemäß den Standardprotokollen für das Auftauen von Zelllinien aufgetaut werden. Wenn Zellen eingefroren sind, werden sie nicht in einem EGF-supplementierten Medium (Wachstumsmedium) resuspendiert. Sie werden in einem basischen Medium (ohne EGF) und einer Gefrierlösung (1/1-Verhältnis) resuspendiert.
7. Keimzellen durch Platzieren von 100 μl der 600 μl Zell-/Mediensuspension in der Mitte von sechs beschichteten Deckgläsern (siehe Schritt 5) der 24-Well-Platte. Legen Sie die Platte vorsichtig in den Inkubator und lassen Sie die Zellen absetzen.
   HINWEIS: 100 μl der 600 μl Zellsuspension (entnommen aus einer Vertiefung einer 12-Well-Platte) führen zu einer Zellkonfluenz von 90 % bis 100 %, die für die Transfektion erforderlich ist.
8. Kontrollieren Sie die Zellen nach 3 h darauf, ob sie sich auf dem Deckglas abgesetzt haben. Zugabe von 400 μl Wachstumsmedium zugesetzt mit EGF.
   HINWEIS: Die Zellen sind in der Regel am nächsten Tag bereit für die Transfektion (Abbildung 3G). Wenn sie nicht zusammenfließen (90%-100%), lassen Sie sie für einen weiteren Tag. Wenn sie immer noch nicht konfluent sind, verwenden Sie sie nicht für die Transfektion. Wenn andere Downstream-Anwendungen durchgeführt werden, wie z. B. miRNA-Profiling, RNA-Seq, RT-qPCR oder Western Blot, müssen die Zellen in 12-Well-Platten (Verhältnis 1:1; keine Plattenbehandlung erforderlich) und für die RNA-/Proteinextraktion geerntet werden.

Abbildung 1: Retinale Dissoziation und Genotypisierung. (A) Augenmuschel mit entfernter Hornhaut, Linse, Iris und Glaskörper. (B) Isolierte Netzhäute; retinale Pigmentepithelzellen (RPE) werden nach einer gründlichen Reinigung entfernt. (C) 12-Well-Platte mit dissoziierten Netzhäuten (zwei Netzhäute pro Well). (D) Ausschnitt aus einem Beispiel für ein Genotypisierungsgel-Bild. Die Genotypisierung ist erforderlich, um die Mäuse zu identifizieren, die eine Ascl1-gesteuerte Cre-Rekombinase-Expression aufweisen, und wird zur Verfolgung der Zellkonversion verwendet. Maßstabsleisten: 1 mm.

Abbildung 2: Experimentelles Design und zeitlicher Verlauf einer primären Müller-Glia-Kultur. (A) Schematische Darstellung der Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl-Maus, einer retinalen Vorläufer-Reportermaus, die zur Verfolgung der Umwandlung von Müller-Gliazellen (MG) in retinale Vorläuferzellen (RPCs) verwendet wird. (B) Zeitlicher Verlauf der Kulturperioden, bestehend aus Wachstumsphase (blau, 0-4/5 Tage in vitro, div), Transfektionsphase (violett, 5/6-7/8 div) und MG-Konversionsphase (gelb, beginnt 7/8 div). Wachstumsphase: Dissoziierte Netzhäute (zwei Netzhäute einer Maus) werden in einer Vertiefung einer 12-Well-Platte in einem Wachstumsmedium gezüchtet. Um den 4./6. Tag herum werden die Zellen in eine 24-Well-Platte überführt, die beschichtete Deckgläser enthält. Transfektionsphase: 5-7 div (1 Tag nach der Passage) Zellen werden 2 Tage lang in Transfektionsmedium mit miRNAs transfiziert. Die Cre-Rekombinase wird mit 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) aktiviert. Die Zellproliferation wird mit EdU verfolgt. Die MG-Konversionsphase beginnt 1 Tag nach der Transfektion. Die Zellen werden nun bis zur Ernte (6-7 Tage nach der Transfektion, dpTF) im neuronalen Medium gezüchtet.

Abbildung 3: Primäre Müller-Gliazellen während der Wachstumsphase. (A) Der zeitliche Verlauf der Kulturperioden während der Wachstumsphase (0-4/5 Tage in vitro (div)) ist blau hervorgehoben. (B-G) Live-Bilder (Phase) der Müller-Gliazellen (MG) während der Wachstumsphase nach 1 div (B), 2 div nach dem Mediumwechsel (C), 3 div (D), 4 div vor der Passage (E,F) und 5 div, 1 Tag nach der Passage und vor der Transfektion (G). MG-Zellkörper sind durch rote Pfeilspitzen gekennzeichnet. Nach 3 div sind die Kulturen zu 60 % bis 80 % konfluent (D), nach 4 bis 5 div sind die Kulturen zu 90 % bis 100 % konfluent und bereit für die Passage (E-F). Nach der Passage auf Deckgläsern müssen die Zellkulturen für die nachfolgende Transfektion zu 80 % bis 90 % konfluent sein (G). Maßstabsleisten: 50 μm (A-D), 100 μm (E), 200 μm (F).