$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
1. Vorbereitung des Puffers
HINWEIS: Wenn Sie eine nachgeschaltete RNA-Sequenzierung durchführen, behandeln Sie alle Arbeitsbereiche und Werkzeuge gründlich mit RNase Dekontaminationslösung, um einen mRNA-Abbau zu verhindern.
- Bereiten Sie den Lysepuffer vor.
- In destilliertem Wasser (H2O) bis zu 50 ml werden 5,47 g Saccharose (0,32 M endg.), 250 μl 1 M Calciumchlorid (CaCl2) (5 mM endgültig), 150 μl 1 M Magnesiumacetat (Mg(CH3COO)2) (3 mM endgültig), 10 μl 500 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (0,1 mM endgültig) gelöst, 500 μl 1 M Tris-Salzsäure (Tris-HCl) (pH 8) (10 mM endgültig), 50 μl Triton X-100 (0,1 % endgültig) und 17 μl 3 M Dithiothreitol (DTT, 1 mM endgültig, frisch zugeben) (siehe Materialtabelle).
- Saccharosepuffer vorbereiten
- In destilliertem H2O bis zu 50 mL werden 30,78 g Saccharose (1,8 M endgültig), 150 μl 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM endgültig), 500 μl 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM endgültig), 17 μl 3 M DTT (1 mM endgültig, frisch zugeben).
2. Dissoziation von gefrorenem Gewebe in Einzelkernsuspension
- Geben Sie 4 mL eiskalten Lysepuffer in einen 7 mL Glasgewebe-Douncer (Grinder) und bewahren Sie ihn auf Eis auf. Präparieren Sie etwa 200-400 mg des frisch gefrorenen menschlichen erwachsenen Kortex, tounce etwa 50x und übertragen Sie das Gewebehomogenat in ein 12-ml-Ultrazentrifugenröhrchen aus Polypropylen.
- Geben Sie mit einer 5-ml-Pipette 6,5 ml eiskalten Saccharosepuffer auf den Boden des Ultrazentrifugenröhrchens, wobei Sie darauf achten, dass die Schicht zwischen Saccharose und dem Gewebehomogenat nicht gestört wird.
HINWEIS: Wenn Sie zusätzliche Proben verarbeiten, gleichen Sie die Röhrchen vorsichtig nach Gewicht aus, indem Sie der leichteren Probe zusätzlichen Lysepuffer hinzufügen. Ein präzises Auswuchten der Ultrazentrifugenröhrchen ist unerlässlich, um Schäden am Rotor zu vermeiden und eine Drehung mit der richtigen Drehzahl zu gewährleisten.
3. Ultrazentrifugation
- Das Lysat wird bei 24.400 U/min (101.814 × g) 1 h lang bei 4 °C ultrazentrifugiert. Der Überstand und die Ablagerungen werden vorsichtig abgesaugt, ohne das Pellet zu stören.
Anmerkung: Ein Pellet ist möglicherweise nicht sichtbar, wenn es mit weniger als 200 mg Gewebe begonnen wird.
- Geben Sie 600 μl phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (Calcium (Ca2+), Magnesium (Mg2+) frei) zum Kernpellet und inkubieren Sie es 10 Minuten lang auf Eis, bevor es wieder suspendiert wird.
- Pipettieren Sie 50 Mal auf und ab, um das Kernpellet auf Eis wieder zu suspendieren.
- Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die intakten Kerne unter einem Mikroskop sichtbar zu machen und sicherzustellen, dass die Konzentration der Resuspension über 105 Kerne/ml liegt, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren (kombinieren Sie 10 μl der resuspendierten Kerne mit 10 μl Trypanblau).
4. Inkubation von Antikörpern
- Um die Probe für die fluoreszenzaktivierte Kernsortierung (FANS) zu immunotaggen, fügen Sie 500 μl des resuspendierten Probenpellets, 490 μl 1x PBS (Ca2+, Mg2+ frei), 10 μl 10 % Rinderserumalbumin (BSA) (0,1 % endgültig), 1 μl Maus-Anti-NeuN-Antikörper hinzu, konjugiert mit AF(Alexa fluor)555 (NeuN-AF555, 1:1000 Endkonzentration), und 1 μl Anti-PAX6-Antikörper der Maus, konjugiert mit Allophycocyanin (PAX6-APC, Endkonzentration 1:1000).
Anmerkung: Alternative Antikörper, die an andere Fluorophore konjugiert sind, können hinzugefügt werden. Hier wurde an AF488 konjugiertes Maus-Anti-OLIG2 (1:1000 Konzentration) mit günstigen Ergebnissen verwendet.
- Führen Sie 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-only- und einfarbige Kontrollen durch, um Gating-Parameter einzurichten, wobei bei Bedarf eine kleine Menge der Probe verwendet wird.
- Um eine einfarbige AF555-Kontrolle durchzuführen, fügen Sie 20 μl des resuspendierten Probenpellets, 970 μl 1x PBS (Ca2+, Mg2+ frei), 10 μl 10 % BSA (0,1 % endgültig) und 1 μl NeuN-AF555-Antikörper (Konzentration 1:1000) hinzu.
- Um eine einfarbige APC-Kontrolle durchzuführen, fügen Sie 20 μl des resuspendierten Probenpellets, 970 μl 1X PBS (Ca2+, Mg2+ frei), 10 μl 10 % BSA (0,1 % endgültig) und 1 μl PAX6-APC-Antikörper (Konzentration 1:1000) hinzu.
- Um eine reine DAPI-Kontrolle (4',6-Diamidino-2-phenylindol) durchzuführen, fügen Sie 20 μl des resuspendierten Probenpellets, 970 μl 1X PBS (Ca2+, Mg2+ frei) und 10 μl 10 % BSA (0,1 % endgültig) hinzu (DAPI wird später hinzugefügt, siehe 4.4).
Anmerkung: Wenn mehr als zwei Antikörper verwendet werden, wird zusätzlich zu den einfarbigen Kontrollen die Durchführung einer Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrolle (FMO) empfohlen.
- Inkubieren Sie die Proben und die Kontrollen mit Rotation im Dunkeln für 1 h bei 4 °C.
- Fügen Sie DAPI im Verhältnis 1:1000 zu allen Stichproben und Kontrollen hinzu, und fahren Sie mit der Sortierung fort.