Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Gewebeentnahme
- Bereiten Sie Puffer X aus dem neuralen Dissoziationskit vor, indem Sie Beta-Mercaptoethanol zu Puffer X bis zu einer Endkonzentration von 0,067 mM hinzufügen (für 4 Proben fügen Sie 13,5 μl 50 mM Beta-Mercaptoethanol zu 10 ml Puffer X hinzu).
- Bereiten Sie Enzymmischung 1 vor, indem Sie für jede Probe 50 μl Enzym P mit 1.900 μl Puffer X mischen, wie im Protokoll für das Neural Dissociation Kit beschrieben. Mischen Sie beispielsweise für 4 Proben 200 μl Enzym P mit 7.600 μl Puffer X.
- Stellen Sie Buffer X bei 37 ºC in das Wasserbad.
- Geben Sie 2 ml kalte Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) (ohne Ca++ und Mg++) in eine Vertiefung einer sterilen 6-Well-Kulturplatte für jede Probe, die entnommen und für die Gewebedissektion auf Eis aufbewahrt wird.
>2. Neuronale Dissoziation (1 Std.)
- Würfeln Sie jede Gewebeprobe mit sterilen Rasierklingen auf dem Deckel der 6-Well-Kulturplatte in kleine Stücke. Dieses Protokoll wurde für Gewebeproben von ca. 30 - 100 mg verwendet, ist aber für Gewebeproben von bis zu 400 mg zugelassen. Bei Gewebeproben mit einem Volumen von mehr als 400 mg müssen die Reagenzvolumina entsprechend hochskaliert werden.
- Verwenden Sie 1 ml frisches HBSS ohne Ca2+ und Mg2+, um die gewürfelten Gewebestücke mit einer Pipette in ein steriles 2-ml-Zentrifugenröhrchen zu überführen. Die Schritte 2.1 und 2.2 werden für alle Proben wiederholt, bis alle Proben in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen überführt wurden.
- Die Proben werden bei 300 x g für 2 min bei RT zentrifugiert und mit Überstand aspiriert.
- Geben Sie 1.900 μl warmen Enzymmix 1, wie in den Schritten 1.2 und 1.3 vorbereitet, zu jeder Probe und verschließen Sie die Röhrchen.
- Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang im 37 ºC heißen Wasserbad und drehen Sie die Röhrchen mehrmals alle 5 Minuten um, um die abgesetzten Gewebestücke wieder zu suspendieren.
- In der Zwischenzeit bereiten Sie Enzymmischung 2 vor, indem Sie 20 μl Puffer Y mit 10 μl aufgetautem Enzym A mischen (für 4 Proben mischen Sie 80 μl Puffer Y mit 40 μl aufgetautem Enzym A).
- Geben Sie 30 μl Enzymmischung 2 in jede Probe und invertieren Sie sie vorsichtig. Nicht wirbeln.
- Dissoziieren Sie jede Gewebeprobe mit der Pasteurpipette "1" und reiben Sie sie 30 Mal auf und ab.
- Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang in einem 37 °C heißen Wasserbad. Drehen Sie die Röhrchen mehrmals alle 5 Minuten um, um die abgesetzten Gewebestücke wieder zu suspendieren.
- Dissoziieren Sie jede Gewebeprobe mit der Pasteurpipette "2" und reiben Sie sie 30 Mal auf und ab, um Blasenbildung zu vermeiden.
- Dissoziieren Sie jede Gewebeprobe mit der Pasteurpipette "3" und reiben Sie sie 30 Mal auf und ab, um Blasenbildung zu vermeiden.
- Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang in einem 37 ºC heißen Wasserbad; drehen Sie die Röhrchen mehrmals alle 5 Minuten um, um die abgesetzten Zellen wieder zu suspendieren.
- Tragen Sie eine einzellige Suspension auf einen 80-Mikron-Zellstamm auf, legen Sie ihn auf ein 15-ml-Falcon-Röhrchen, um alle großen Schmutzpartikel zu entfernen, und waschen Sie den Filter und die Zellen mit 10 ml HBSS (mit Ca2+ und Mg2+), um die Enzymreaktionen zu stoppen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis jede Probe in ein sauberes 15-ml-Falcon-Röhrchen überführt ist.
- Die Proben werden bei 300 x g für 10 min bei RT zentrifugiert und der Überstand abgesaugt.
>3. Myelinabbau (45 min)
- Das Pellet der Zellen wird gründlich mit 400 μl Myelinentfernungspuffer resuspendiert.
- Fügen Sie eine bestimmte Menge der Myelinentfernungskügelchen hinzu und pipettieren Sie sie auf und ab, um sie gründlich zu mischen.
Anmerkung: Das Volumen der verwendeten Myelinentfernungsperlen hängt von der Größe des Gewebes, dem Alter des Tieres und der Menge an Myelin ab, die in dieser bestimmten Gehirnregion erwartet wird. Inkubieren Sie beispielsweise eine Hippocampus-Probe einer adulten Ratte (ca. 300 mg) mit 100 μl Myelinentfernungsperlen.
- 15 min im Kühlschrank bei 4 ºC inkubieren.
- Waschen Sie jede Probe mit 5 ml Myelinentfernungspuffer
.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 300 x g für 10 min bei RT.
- Legen Sie während des Zentrifugierens der Proben 1 Säule für jede Probe in das Magnetfeld des Magnetsortierers und platzieren Sie einen sauberen 80-Mikron-Filter auf jeder Säule.
- Bereiten Sie die Säulen und den Filter vor, indem Sie jede Säule dreimal (insgesamt 3 ml) mit 1 ml Myelinentfernungspuffer spülen. Sammeln Sie den gesamten Durchfluss in einem Abfallbehälter, z. B. auf dem Boden einer leeren Kippbox.
- Positionieren Sie ein 5-ml-Röhrchen aus Polystyrol mit rundem Boden direkt unter jeder Säule, um die Probenentnahme vorzubereiten.
- Wenn die Zellen die Zentrifugation beendet haben, aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie ihn gründlich wieder in 500 μl Myelinentfernungspuffer. Tragen Sie die Zellsuspension sofort auf die Säule auf und sammeln Sie die Zellen im darunter liegenden Röhrchen.
- Waschen Sie den Filter und die Säule 4 Mal mit 1 ml Myelinentfernungspuffer (insgesamt 4 ml).
- Zentrifugieren Sie die Zellsammlung bei 300 x g für 10 min bei RT.
- Aspirieren Sie den Überstand und die Zellen sind nun bereit für die Färbung.
>4. Färben von lebenden Zellen für FACS (1 Stunde für die Färbung)
- Die Zellen kurz (2 Sekunden) vortexen, um das Pellet zu trennen, und sofort 5 μl Fc-Block (Anti-Cluster der Differenzierung 32, CD32) hinzufügen, erneut vortexen und im Kühlschrank bei 4 ºC für 5 min inkubieren.
- In der Zwischenzeit bereiten Sie die Primärantikörpermischung vor, indem Sie die drei Primärantikörper wie folgt in Waschpuffer geben: 0,125 μl Allophycocyanin (APC)-konjugierter CD11b-Antikörper (1:800), 1 μl Anti-GLT1-Antikörper (1:100) und 0,4 μl Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) – konjugierter Thy1-Antikörper (1:250) pro 100 μl Waschpuffer. Jede Probe erhält 100 μl Primärantikörpermischung zur Inkubation; Wenn Ihre Probe jedoch viel größer als 400 mg Gewebe ist, sollten Sie in Betracht ziehen, das Volumen Ihrer primären Antikörpermischung entsprechend zu erhöhen
- Bereiten Sie die Röhrchen für die Einzelfärbekontrolle vor, indem Sie nur 2 μl Zellen aus jedem Probenröhrchen entfernen und in jedes einzelne Färbekontrollröhrchen geben. Zu den "Einzelfärbe"-Kontrollen gehören: nur APC-CD11b, nur GLT1, nur FITC-Thy1, nur PE-Sekundärantikörper und die "blinde" oder ungefärbte Kontrolle.
Anmerkung: Alle Proben sollten in allen Färbekontrollen vertreten sein, d.h. 2 μl Zellen aus jeder Probe sollten in jedes Färbekontrollröhrchen gegeben werden.
- Die Röhrchen kurz vortexen (2 Sekunden) und 100 μl Primärantikörpergemisch in jedes Probenröhrchen und 100 μl des entsprechenden Primärantikörpers in jedes Färbekontrollröhrchen geben, die Röhrchen erneut vortexen, die Röhrchen mit Aluminiumfolie abdecken, um die fluoreszierenden Antikörper vor jeglichem Licht zu schützen, und die Röhrchen 20 Minuten lang bei 4 ºC im Kühlschrank inkubieren. Die Proben sollten für den Rest des Verfahrens kühl (bei 4 °C) aufbewahrt werden, um die Integrität der Proben und der Antikörper zu erhalten.
- Wirbeln Sie die Röhrchen kurz vor und geben Sie 2 ml Waschpuffer in jedes Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 350 x g für 5 min bei 4 ºC.
- In der Zwischenzeit bereiten Sie die Sekundärantikörpermischung vor, indem Sie 0,2 μl PE-konjugierten Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper pro 100 μl Waschpuffer hinzufügen. Jede Probe erhält 100 μl Sekundärantikörpermischung; Wenn Ihre Probe jedoch viel größer als 400 mg Gewebe ist, sollten Sie in Betracht ziehen, das Volumen Ihrer primären Antikörpermischung entsprechend zu erhöhen.
- Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, kippen Sie den Überstand jeder Probe in die Spüle und tupfen Sie die Röhrchen kopfüber auf ein Papiertuch.
- Die Röhrchen kurz vortexen und 100 μl Sekundärantikörpermischung in jedes Probenröhrchen und den entsprechenden Sekundärantikörper in jede Färbekontrolle geben. Dann die Röhrchen erneut vortexen, mit Alufolie abdecken und im Kühlschrank bei 4ºC für 15 Min. inkubieren
Anmerkung: Das GLT1-Färbungskontrollröhrchen sollte die Sekundärantikörpermischung erhalten.
- Nach der Inkubation die Röhrchen kurz vortexen und 2 ml Waschpuffer in jedes Röhrchen geben.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 350 x g für 5 min bei 4ºC.
- Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, kippen Sie den Überstand jeder Probe in die Spüle und tupfen Sie die Röhrchen kopfüber auf ein Papiertuch.
- Wirbeln Sie die Röhrchen vor und geben Sie 0,25 ml steriles PBS in jedes Röhrchen. Die Proben stehen zur Sortierung bereit.
Anmerkung: Weitere Zellen können 0,5 ml steriles PBS benötigen; Es ist jedoch am besten, mit einem geringeren Volumen zu beginnen, da die Probe immer verdünnt werden kann, wenn sie zu stark mit Zellen konzentriert ist.
Anmerkung: Optional können Sie dem Röhrchen DNase hinzufügen, um zu verhindern, dass die Zellen verklumpen und somit den Sortierer verstopfen. Die Proben können auch mit einem sterilen 80-Mikron-Filter kurz vor der Sortierung gefiltert werden, um eine Verstopfung des Sortierers zu vermeiden.
