Isolierung von Neuronen aus Caenorhabditis elegans durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung

Zusammenfassung

Quelle: Deutschland, E. M., et al. Isolierung spezifischer Neuronenpopulationen aus dem Spulwurm Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt die Isolierung von fluoreszenzmarkierten Neuronen aus Caenorhabditis elegans. Eine Zellsuspension wird aus transgenen Würmern gewonnen, die so konstruiert wurden, dass sie fluoreszierende proteinfusionierte vesikuläre Transmembrantransporter in cholinergen Neuronen exprimieren. Die fluoreszenzmarkierten Neuronen werden dann mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) isoliert und in Kultur aufbewahrt.

Protokoll

>1. Vorbereitung und Sammlung von gealterten Würmern für die Zellisolierung

1. Sammeln Sie Würmer und bereiten Sie Puffer für die Zellisolierung vor.
   1. Sammeln Sie die Würmer in einem konischen 15-ml-Röhrchen. Die Würmer aus der Platte mit 1,5 mL M9-Puffer (1 mM MgSO₄, 85 mM NaCl, 42 mM Na₂HPO 4,7H₂O, 22 mM KH₂PO₄, pH 7,0) waschen und 5 min bei 1.600 x g zentrifugieren. Überstand verwerfen und Würmer mit 1 ml M9-Puffer waschen. Wiederholen Sie das Zentrifugieren und Waschen insgesamt fünfmal, um so viel Escherichia coli-Kontamination wie möglich zu entfernen.
      HINWEIS: Die Zugabe von Antibiotika (50 μg/ml) wie Ampicillin in diesem Schritt kann dazu beitragen, die bakterielle Kontamination zu reduzieren.
   2. Bereiten Sie für zwei Proben 2 ml Natriumdodecylsulfat-dithiothreitol (SDS-DTT)-Lysepuffer vor: 200 mM DTT, 0,25 % (w/v) SDS, 20 mM HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure) (pH 8,0) und 3 % (w/v) Saccharose.
   3. Bereiten Sie 15 mL Isolationspuffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 25 mM HEPES [pH 7,3]) vor und lagern Sie ihn auf Eis.
      Anmerkung: Sowohl der SDS-DTT-Lysepuffer als auch der Isolationspuffer müssen vor jedem Experiment frisch gemacht werden.
2. Nagelhautaufschluss und Einzelzellisolierung
   1. Die in Schritt 1.1.1 gesammelten Tiere werden 5 min lang bei 1.600 x g zentrifugiert. Entfernen Sie alle Überstände und suspendierten Würmer in 1 ml M9-Medium und geben Sie sie in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
   2. Pelletschnecken mit Zentrifugation bei 1.600 x g für 5 min.
   3. Geben Sie 200 μl SDS-DTT-Lysepuffer zu den Würmern und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT). Würmer sollten am Körper entlang "gewunden" erscheinen, wenn man sie unter einem Lichtmikroskop betrachtet.
      Anmerkung: Eine längere Exposition gegenüber SDS-DTT-Lysepuffer kann zum Tod von Würmern führen, was durch Beobachtung von Würmern überwacht werden kann. Würmer, die tot sind, verlängern sich und kräuseln sich nicht.
   4. 800 μl eiskalten Isolationspuffer hinzufügen und durch leichtes Bewegen des Röhrchens mischen.
   5. Pellet-Würmer für 1 min bei 13.000 x g bei 4 °C, Überstand entfernen und mit 1 mL Isolationspuffer waschen.
   6. Wiederholen Sie Schritt 1.3.5 insgesamt fünfmal und entfernen Sie dabei jedes Mal vorsichtig den Isolationspuffer.
   7. Geben Sie 100 μl Proteasemischung aus Streptomyces griseus (15 mg/ml) (Materialtabelle), gelöst in Isolationspuffer, in das Pellet und inkubieren Sie es 10-15 min lang bei RT.
      Anmerkung: Wie beim SDS-DTT-Lysepuffer kann der verlängerte Proteaseverdau zu einer übermäßigen Spaltung von Proteinen entlang der Plasmamembran führen, wodurch die Isolierung des oberflächenexponierten grün fluoreszierenden Proteins (GFP) über magnetische Beads verhindert wird.
   8. Während der Inkubation mit der Proteasemischung wenden Sie eine mechanische Disruption an, indem Sie die Proben mit einer 200-μl-Mikropipettenspitze ~60-70 Mal auf und ab gegen den Boden des 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchens pipettieren. Halten Sie die Pipettenspitze mit konstantem Druck an die Wand des Mikrozentrifugenröhrchens, um die Zellen richtig zu trennen.
   9. Um das Stadium des Aufschlusses zu bestimmen, entnehmen Sie ein kleines Volumen (~1-5 μL) des Aufschlussgemisches, lassen Sie es auf einen Objektträger fallen und untersuchen Sie es mit einem Gewebekulturmikroskop. Nach 5-7 min Inkubation sollten die Wurmfragmente eine sichtbar reduzierte Kutikula aufweisen und ein Zellschlamm ist deutlich sichtbar.
   10. Stoppen Sie die Reaktion mit 900 μl kommerziell erhältlichem kaltem L-15-Medium von Leibovitz, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und Penicillin-Streptomycin (Endkonzentration bei 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin).
   11. Isolierte Fragmente und Zellen werden durch Zentrifugation für 5 min bei 10.000 x g bei 4 °C pelletiert. Waschen Sie die pelletierten Zellen noch zweimal mit 1 mL kaltem, mit L-15 supplementiertem Medium, um sicherzustellen, dass überschüssige Ablagerungen und Nagelhaut entfernt werden.
   12. Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in 1 mL L-15-supplementiertem Medium und lassen Sie sie 30 Minuten lang auf Eis. Nehmen Sie die oberste Schicht, ca. 700-800 μl, in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Diese Schicht enthält Zellen ohne Zelltrümmer und wird bei der anschließenden Isolierung von Zellen von Interesse verwendet.
   13. Verwenden Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers einen automatisierten Zellzähler oder ein Hämozytometer, um die Zelldichte von 10-25 μl isolierter Zellen zu messen.

>2. Isolierung von GFP-positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie

1. Isolierung von GFP-positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie
   1. Aus der isolierten Zellsuspension, die in Schritt 1.2.12 entnommen wurde, zentrifugieren die Zellen 5 min lang bei 10.000 x g bei 4 °C. Überstand verwerfen und pelletierte Zellen in L-15-supplementiertem Medium auf eine Zelldichte von nicht mehr als 6 x 10⁶ Zellen/ml suspendieren, um eine Überlastung des Durchflusszytometers zu vermeiden.
   2. Sortieren Sie die Zellen nach GFP-positiver Expression mit einem Durchflusszytometer, das Proben sortieren kann. GFP-negative Zellen können als Kontrolle für nicht-zelltypspezifische Analysen verwendet werden.
2. Kultivierung isolierter Zellen
   1. Isolierte Zellen werden in eine sterile 6-Well-Multiwell-Platte überführt.
      Anmerkung: Diese Platten können mit Erdnusslektin beschichtet werden, um die Zelladhäsion zu erhöhen. Sollen Zellen jedoch sofort verwendet werden, kann dieser Schritt vernachlässigt werden.
   2. Legen Sie die Platte in einen Plastikbehälter und inkubieren Sie die Zellen bei 20 °C mit einem feuchten Tuch oder weichem Seidenpapier (geben Sie 50 μg/ml Ampicillin in doppelt destilliertes Wasser [ddH₂O], um sicherzustellen, dass kein Bakterienwachstum auf dem Tuch vorhanden ist), um den Zellen Feuchtigkeit zuzuführen. Inkubieren Sie nicht in einem CO₂ -Inkubator, da erhöhte CO₂ -Werte die Zellen schädigen können.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
6-Well-Platte	Fisher Scientific	Tel.: 12-556-004
Agar, Molekularbiologie	VWR	Nr. A0930
CaCl2	Sigma	Nr. C5670
Contess Automatisierter Zellzähler	Invitrogen	Z359629
DVB-T	USBilogisch	Nr. D8070
FBS	Omega Scientific	FB-02
HEPES	Sigma	Nr. H3375
Kcl	Amresco	Nr. O395
KH2PO4	USBilogisch	Nr. P5110
Kimwipes	Kimberly-Clark Fachleute	7552
Leibovitz' L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBilogisch	Nr. M2090
Na2HPO4·7H2O	USBilogisch	Nr. S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleichmittel)	Clorox
NaOH	Amresco	Nr. O583
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Pepton Y	USBilogisch	Nr. P3306
Pronase E	Sigma	7433	Proteasemischung aus Streptomyces griseus
Sds	Amresco	O227
SMT1-FLQC Fluoreszenz-Stereomikroskop	Tritech-Forschung
Saccharose	USBilogisch	Nr. S8010

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