Gewinnung von Kleinhirnschnitten aus einem embryonalen Kükengehirn

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Dissektion eines Hühnerembryos Tag 14 (e14) Kleinhirn

Die
1. Eier braun befruchteter Hühner werden bei 38 °C bis zum Embryonaltag 14 bebrütet.
2. Enthaupten Sie den Hühnerembryo mit einer Eischere in der Eizelle und legen Sie den Kopf in eine Petrischale, die eiskalte Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) enthält (Abbildung 1A).
3. Machen Sie mit einer Standardzange Schnitte hinter jedem Auge durch das gesamte Gewebe und entfernen Sie die Augen und den Oberkiefer. Machen Sie einen zweiten Schnitt durch den gesamten Rachen und entfernen Sie den Unterkiefer (Abbildung 1B).
4. Entfernen Sie mit einer Standardzange die gesamte Haut von der Oberfläche eines Schädels, indem Sie sie abziehen (Abbildung 1C) und entfernen Sie Stirn- und Scheitelknochen, wodurch das Gehirn freigelegt wird.
5. Aus ventraler Sicht den Rachenknorpel und das Hilfsmesenchym entfernen.
6. Aus dorsaler Sicht entfernen Sie vorsichtig das Mesenchym dorsal zum Hinterhirn, achten Sie darauf, die Pia nicht zu beschädigen, und trennen Sie das gesamte Gehirn (Abbildung 1D).
7. Machen Sie einen Schnitt durch das gesamte Gewebe zwischen Mittelhirn und Hinterhirn und trennen Sie das Hinterhirn einschließlich des Kleinhirns (Abbildung 1E).
8. Entfernen Sie das gesamte Kleinhirn, indem Sie Schnitte durch das gesamte Gewebe an beiden lateralen Verbindungsstellen des Kleinhirns und der Flügelplatte des Hinterhirns vornehmen, wobei Sie darauf achten, dass die Integrität der Pia während der gesamten Dissektion erhalten bleibt (Abbildung 1F). Entfernen Sie auch den sich bildenden Plexus choroideus (Abbildung 1G).
9. Bewegen Sie das präparierte Kleinhirn in die eiskalte Hank's Balanced Salt Solution (HBSS).

>2. Schnittkultur von e14 Cerebellum

1. Übertragen Sie das gesamte Kleinhirn mit einem Spatel oder einer 3-ml-Pasteurpipette auf die sterile Plattform eines Tissue Choppers, wobei die Spitze weggeschnitten wird, um die Öffnung zu erweitern. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einer Pipette.
2. Schneiden Sie das gesamte Kleinhirn in der gewünschten Ausrichtung bei einer Dicke von 300 μm mit dem Gewebehacker-Set mit einer Schnittgeschwindigkeit von maximal 50 %. Die Integrität des Gewebes ist im sagittalen Schnitt am einfachsten zu erhalten; Die Orientierung ist jedoch auch ein wichtiger Aspekt für die Zellanalyse (Purkinje-Zell-Dendriten sind sagittal ausgerichtet, während Körnerzellaxone quer verlaufen, senkrecht zur Ebene der Purkinje-Zell-Dendriten).
3. Mit einer 3-ml-Pasteur-Pipette das in Scheiben geschnittene Kleinhirn mit eiskaltem HBSS bedecken.
4. Übertragen Sie die Scheiben in HBSS mit einer 3-ml-Pasteur-Pipette mit einer abgeschnittenen Spitze in eine 60-mm-Petrischale mit eiskaltem, frischem HBSS.
5. Unter einem Präpariermikroskop, das mit einer faseroptischen Lichtquelle beleuchtet ist, die Trennung der einzelnen Scheiben mit einer Uhrmacherzange sicherstellen.
   Anmerkung: Jede Dissektion, vom Embryo bis zur Scheibeninkubation im Kulturmedium, dauert je nach Erfahrung etwa 10-20 Minuten. Führen Sie die Dissektionen nacheinander durch, um sicherzustellen, dass das Kleinhirn die minimale Zeit zwischen der Enthauptung und der Ex-vivo-Kultur verbringt.

Abbildung 1. Dissektion des Kleinhirns von E14-Hühnerembryonen. (A) Das Küken im Ei enthaupten und den Kopf in eine Petrischale mit eiskaltem PBS geben. Entfernen Sie den Unterkiefer und die Augen, indem Sie einen Schnitt hinter den Augen und dem Rachen machen (gestrichelte Linie). (B) Entfernen Sie die Haut von der Oberfläche des Schädels. (C) Entfernen Sie die Stirn- und Scheitelknochen und (D) entfernen Sie das Gehirn aus dem Mesenchym und dem Knorpel, die es umgeben. (E) Bestimmen Sie unter einem Präpariermikroskop die Position des Kleinhirns am hinteren Ende des Gehirns. Schneiden Sie zwischen dem Mittelhirn und dem Hinterhirn (gestrichelte Linien), um das Kleinhirn und das ventrale Hinterhirn zu erhalten. (F) Machen Sie Schnitte an den lateralen Verbindungsstellen (Stielen) des Kleinhirns, um das Kleinhirn vom Hinterhirn zu trennen (gestrichelte Linie). (G) Entfernen Sie den Plexus choroideus (Sternchen) von der ventralen Seite des Kleinhirns, bis Sie ein ganzes intaktes Kleinhirn mit der Pia übrig haben. Übertragen Sie das Kleinhirn in eiskaltes HBSS, bevor Sie die Scheiben mit einem Zerkleinerer vorbereiten.