Etablierung primärer gemischter Gliazellkulturen aus dem Rückenmark einer Maus

Zusammenfassung

Quelle: Malon, J. T., et al. Vorbereitung von primären gemischten Gliakulturen aus adultem Rückenmarksgewebe von Mäusen. J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Isolierung und Kultivierung von primären gemischten Gliazellen aus adultem Rückenmarksgewebe von Mäusen. Das Protokoll beinhaltet die enzymatische Verdauung des Gewebes, gefolgt von der Entfernung von gebrochenen Zellmembranen und Myelintrümmern, um eine Einzelzellpopulation zu erhalten. Die Zellen werden dann in Medien kultiviert, die für das Wachstum gemischter Gliazellen optimiert sind.

Protokoll

>1. Herstellung von Lösungen in einer Kulturhaube unter aseptischen Bedingungen

1. Nährmedien vorbereiten: Dulbeccos Modifikation des Eagle-Mediums (cDMEM) mit DMEM (mit 4,5 g/l Glukose), 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 I.E./ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin, 250 ng/ml Amphotericin B und 50 μM 2-Mercaptoethanol (2-ME; siehe 1.1.1) abschließen. Mischen und filtrieren, sterilisieren Sie alle anderen Komponenten und fügen Sie dann FBS hinzu. Lagern Sie den Nährboden bei 4 ^°C.
   1. Bereiten Sie 50 mM 2-ME/phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu: Geben Sie 100 μl konzentriertes 2-ME (14,3 M) in 28,6 mL 1x PBS und sterilisieren Sie es mit dem Filter (die Lösung kann mehrere Monate bei 4 ^°C gelagert werden). Verwenden Sie 1 ml 2-ME-Stammlösung pro 1.000 ml Nährmedium.
2. Vorbereitung des Dichtegradientenmediums
   1. Bereiten Sie eine isotonische Dichtegradientenlösung (z. B. 100 % Percoll) aus 1 Teil 10x regulärem sterilem PBS und 9 Teilen sterilem Dichtegradientenmedium (z. B. Percoll) her.
   2. Verdünnen Sie das 100 % Dichtegradientenmedium (hergestellt in 1.2.1) mit normalem 1x sterilem PBS, um ein 20 % Dichtegradientenmedium herzustellen (z. B. 10 mL 100 % Dichtegradientenmedium mit 40 mL 1x PBS) und lagern Sie es bei 4 ^°C. Bringen Sie das 20 % Dichtegradientenmedium auf Raumtemperatur (RT), bevor Sie die Zellkultur vorbereiten.
3. Vorbereitung der Lösungen aus dem Papain-Dissoziationssystem
   HINWEIS: Das Papain-Dissoziationssystem ist in der Materialtabelle zu finden. Andere ähnliche Dissoziationskits (einschließlich solcher, die im eigenen Haus montiert wurden) können ebenfalls verwendet werden. Alle Komponenten müssen steril sein.
   1. Geben Sie 32 ml Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) in die Ovomucoid-Hemmermischung (Pulver).
   2. Geben Sie 5 ml EBSS in eine Durchstechflasche (Pulver). Stellen Sie das Papain-Fläschchen für 10 Minuten in ein 37 ^°C heißes Wasserbad oder bis sich das Papain aufgelöst hat.
   3. 500 μl EBSS in ein DNase-Fläschchen (Pulver) geben. Vorsichtig mischen.
   4. Geben Sie 250 μl der DNase-Lösung (oben) in die Durchstechflasche Papain.
   5. Berechnen Sie die benötigte Gesamtmenge des oben genannten Papain/DNase-Gemisches (ca. 800 μl Papain/DNase-Gemisch pro Rückenmark der Maus) und überführen Sie das benötigte Gemisch in ein 50-ml-Röhrchen für die Gewebeverdauung. Lagern Sie die Reste in der Originaldurchstechflasche mindestens zwei Wochen lang bei 4 °C.
   6. Bewahren Sie alle Komponenten aus den Kits bis zur Verwendung auf Eis auf.
4. Bereiten Sie die Röhrchen für die Rückenmarksentnahme vor: ein steriles 15-ml-Röhrchen mit 5 mL Hank's balanced Salt Solution (HBSS; aus dem Papain-Dissoziationssystem, zur Entnahme des Rückenmarks) und ein steriles 15-ml-Röhrchen mit 1x PBS (zum Auffüllen der 5-ml-Spritze). Bereiten Sie zusätzlich eine sterile Petrischale (35 mm oder 60 mm) mit 5 mL HBSS vor und bewahren Sie sie in der Kulturhaube auf.

>2. Herstellung der einzelligen Suspension

Hinweis: Führen Sie die Schritte 3 und 4 in einer Kulturhaube aus, um alles steril zu halten.

1. Übertragen Sie alle Rückenmark in die HBSS-haltige Petrischale. Schneiden Sie jedes Rückenmark mit einer sterilen Schere und Pinzette in viele feine, kleine Stücke. Das Rückenmarksgewebe wird mit einer sterilen Pinzette oder einer 10-ml-Pipette in das konische 50-ml-Röhrchen mit dem vorbereiteten Papain/DNase-Enzymgemisch (Schritt 1.3.5) überführt (vermeiden Sie die Zugabe von HBSS zum Enzymgemisch, da dies die vorbereitete Enzymlösung weiter verdünnt und zu einer verminderten Leistung des Enzyms führen kann).
2. Wirbeln Sie das Röhrchen vorsichtig vor, um es zu mischen. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 ^°C für 1 h in einem Inkubator/Shaker mit Orbitalschütteln bei 150 U/min.
3. Wirbeln Sie das Röhrchen erneut vor und zerkleinern Sie die Enzymlösung mit dem Gewebe kräftig mit einer 5-ml-Pipette, um die weitere Dissoziation zu fördern.
4. Die Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen überführen und bei 300 x g 5 min bei RT zentrifugieren.
5. Während der Zentrifugation werden 2,7 ml EBSS mit 300 μl rekonstituierter Albumin-Ovomucoid-Inhibitorlösung (1.3.1) in einem sterilen Röhrchen gemischt. 150 μl der DNase-Lösung zugeben (Schritt 1.3.3).
6. Nach der Zentrifugation wird der Überstand entfernt und das Küvettenpellet mit der oben vorbereiteten Lösung (Schritt 1.5) wieder suspendiert. Vortexen Sie gut, um das Zellpellet zu brechen.
7. 3 ml rekonstituierte Albumin-Ovomucoid-Inhibitorlösung (Schritt 1.4.1) werden in die Zellsuspension gegeben. Zellen bei 70 x g für 6 min bei RT zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand (der Membranfragmente enthält).

>3. Weitere Entfernung von Myelin aus der einzelligen Suspension

1. Geben Sie 8 ml 20 % Dichtegradientenmedium (hergestellt in Schritt 1.2.2) in das Röhrchen mit dem Zellpellet, wirbeln Sie es vorsichtig vor, um das Pellet aufzubrechen, und zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 x g für 30 min bei RT ohne Bremsen. Entfernen Sie vorsichtig die oberste Schicht aus Schmutz (hauptsächlich Myelin) und den Überstand, aber bewahren Sie das Pellet auf.
2. Um Reste des Dichtegradienten zu entfernen, waschen Sie die Zellen, indem Sie das Zellpellet mit 8 mL eines verdünnten cDMEM (1 Teil cDMEM und 2 Teile HBSS) resuspendieren. Die Zellen werden bei 400 x g für 10 min bei 4 ^°C zentrifugiert. Den Überstand entfernen und die Zellen erneut mit dem verdünnten cDMEM (oben) auf die gleiche Weise waschen. Bewahren Sie die Zellen bis zur Aussaat auf Eis auf.
3. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in Kulturmedien (cDMEM wird mit 2-ME geliefert (in Schritt 1.1 hergestellt)). Verwenden Sie für eine 12-Well-Platte 3 ml x 4 (Anzahl der verwendeten Mäuse) + 2 ml = 14 ml-Medien. Dadurch wird sichergestellt, dass genügend Zellsuspension für die gesamte Platte (12 Wells) vorhanden ist, und es stehen zusätzliche Wells zur Verfügung, mit denen die durchschnittliche Zellzahl pro Well und der Mikrogliagehalt der Kultur bestimmt werden können. Wenn andere Arten von Kulturgefäßen verwendet werden, berechnen Sie das Gesamtvolumen des benötigten Nährmediums anteilig.
4. Geben Sie 1 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte.
5. Inkubieren Sie die Zellen bei 35,9 ^°C mit 5 % CO₂.
6. Wechseln Sie das Medium (entfernen Sie das alte Medium durch Aspiration) an D 1 und danach alle 3 - 4 Tage (wechseln Sie normalerweise das Medium an D: 1, 4, 8 und 11 und verwenden Sie dann die Zellen am Tag 12).
   Anmerkung: An Tag 1 kann die Kultur aufgrund des Myelinrückstands aus dem Rückenmarksgewebe erhebliche Mengen an Ablagerungen enthalten. Es empfiehlt sich daher, das Medium an Tag 1 zu wechseln. Die Kulturen sind zwischen D 12 - 14 zur Behandlung bereit. Zellen sind in der Regel zu 80 % bei D 12 konfluent und können bei D 14 zu nahezu 100 % konfluent sein. Typischerweise befinden sich auf D 12 etwa 100.000 Zellen pro Vertiefung in einer 12-Well-Platte.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dulbeccos Modifikation des Eagle-Mediums (DMEM) mit 4,5 g/L Glukose	Lonza	12-709F	Bei dem cDMEM-Medium handelt es sich um ein weit verbreitetes Standard-Nährmedium. Der einzelne Forscher kann selbst entscheiden, wo er das DMEM und alle anderen Komponenten, die zur Herstellung von cDMEM-Medien verwendet werden, erwerben möchte.
L-Glutamin (100x)	Lonza	17-605E	Das L-Glutamin ist eine standardmäßige, weit verbreitete Komponente für verschiedene Nährmedien. Einzelne Forscher können entscheiden, wo sie L-Glutamin kaufen.
Antibiotisch-antimykotische Lösung (100x)	Corning-Mediatech	30-004-CI	Dies ist eine Kombination aus Penicillin, Streptomycin und Amphotericin, die so formuliert ist, dass sie 10.000 Einheiten/ml Penicillin G, 10 mg/ml Streptomycinsulfat und 25 μg/ml Amphotericin B enthält. Einzelne Forscher können entscheiden, wo sie einzelne Komponenten kaufen.
2-Mercaptoethanol (2-ME)	Sigma-Aldrich	Nr. M3148	Ein BioReagenz, das für Zellkultur, Molekularbiologie und Elektrophorese geeignet ist.
Papain-Dissoziationssystem	Worthington Biochemical Corporation	LK003150	Einzelne Komponenten dieses Kits können separat erworben werden.
Percoll	GE Gesundheitswesen	Artikel-Nr.: 17-0891-01	Percoll wird als sterile Lösung verkauft. Unverdünntes Percoll kann bei Bedarf erneut autoklaviert werden.
Inkubator/Schüttler für Laborlinien	Barstead/Lab-Linie	MaxQ4000	Dies ist der Inkubator/Shaker, den wir derzeit haben. Stattdessen können auch andere Arten von Shakern verwendet werden.

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