Differenzierung von otischen Vorläuferzellen in sensorische Epithelzellen mit anschließender Immunfärbung

Zusammenfassung

Quelle: Azadeh, J. et al., Initiating Differentiation in immortalized multipotent otic progenitor cells.J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video zeigt die Differenzierung von immortalisierten multipotenten otischen Vorläuferzellen (iMOP) in sensorische Epithelzellen. Es werden die Schritte beschrieben, die bei der Kultivierung von iMOP-Zellen, der Bildung von Otosphären, der Induktion der Differenzierung und der Visualisierung zellulärer Komponenten und Differenzierungsmarker durch Fluoreszenzmikroskopie erforderlich sind, um eine erfolgreiche Zelldifferenzierung zu bestätigen.

Protokoll

>1. Aufrechterhaltung der Selbsterneuerung in IMOP-Zellen

1. Bereiten Sie iMOP-Kulturmedien vor: DMEM/F12, 1X B27-Supplement, 25 μg/ml Carbenicillin und 20 ng/ml basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF). Stellen Sie 50 ml iMOP-Nährmedien mit sterilen Reagenzien her. 49 ml DMEM/F12 in einem 50 ml konischen Wasserbad in einem 37 °C warmen Wasserbad erwärmen.
   1. 50X B27 Supplement auftauen und 100 mg/ml Carbenicillin-Aliquots 5 min lang in einem 37 °C Wasserbad filtrieren. 100 μg/ml bFGF aliquot bei RT auftauen. 1 ml 50X B27, 10 μl 100 μg/ml bFGF und 12,5 μl 100 mg/ml Carbenicillin in DMEM/F12 geben.
2. Verwenden Sie 3 ml Medium in einer 60-mm-Gewebekulturschale für die Kultivierung von iMOP-Zellen. Fügen Sie Kulturen jeden zweiten Tag neue Medien hinzu, indem Sie das Medienvolumen verdoppeln. Es ist darauf zu achten, dass die Konzentration von bFGF nicht unter 5 ng/ml fällt.
   1. Kultivieren Sie iMOP-Zellen bei 37 °C mit 5 % CO_2. Passagezellen in Kultur nach 5 - 7 Tagen, wie in den folgenden Schritten aufgeführt. Die Kultur mit einer 10-ml-Pipettenspitze auf einen 15-ml-Konus übertragen.
3. Stellen Sie 1 mM EDTA in HBSS her, indem Sie 0,1 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 in 50 ml HBSS verdünnen. 1 mM EDTA aus HBSS in einem 37 °C warmen Wasserbad vorwärmen.
4. Ernte der Zellen durch Schwerkraftsedimentation oder Zentrifugation bei 200 x g für 5 min bei RT. Für die Schwerkraftsedimentation stellen Sie den 15 ml Konus mit den Kulturen für 5 - 10 min in den 37 °C Inkubator. Beobachten Sie, wie sich nach dieser Zeit die Otosphären am Boden des konischen 15-ml-Gehäuses sammeln.
   Anmerkung: Eine zu hohe Zentrifugalkraft kann zu Zellschäden führen.
5. Aspirieren Sie verbrauchte Medien vorsichtig mit einer 2-ml-Aspirierpipette, ohne das Zellpellet zu stören. Geben Sie 0,5 ml vorgewärmte 1 mM EDTA HBSS-Lösung in das Zellpellet. Mit einer P1000-Pipette vorsichtig 2 - 3 Mal auf und ab pipettieren. Konisch bei 37 °C erhitzen und <5 Minuten inkubieren, um die Dissoziation in einzelne Zellen zu erleichtern.
6. Schwenken Sie die Zelllösung vorsichtig, um festzustellen, ob die Otosphären dissoziiert sind. Wenn sich keine Otosphären am Boden des Konischen ablagern, werden die Zellen dissoziiert. Die Inkubationszeit kann variieren.
   Anmerkung: Eine längere Inkubation mit EDTA führt zu einem übermäßigen Zelltod.
7. Entfernen Sie die Zellen bei 37 °C, fügen Sie 2 ml Medium hinzu, um das EDTA zu neutralisieren und zu verdünnen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 200 x g für 5 min bei RT. Aspirieren Sie verdünntes EDTA mit einer 2-ml-Aspirationspipette und fügen Sie 5 ml 1X PBS hinzu, um die Zellen zu waschen.
8. Schleudern Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei RT herunter und aspirieren Sie 1X PBS mit einer 2-ml-Aspirationspipette. Resuspendieren Sie die Zellen mit einer P1000-Pipette in 0,5 ml iMOP-Kulturmedium, indem Sie 2 - 3 Mal vorsichtig auf und ab pipettieren.
9. Zählen Sie die Zellen mit einem mikrofluidischen Partikelzähler mit den entsprechenden Kassetten. Eine konfluente Platte aus iMOP-Zellen enthält ~6 X10⁶ Zellen. Die Zellen werden im Verhältnis 1:100 in Medien verdünnt und 75 μl Zelllösung zur Zählung in die Kassette gegeben. Platte 1 x 10⁶ Zellen in einer 6 cm Schale in iMOP-Nährmedien (~1:10 Verdünnung). Passage iMOPs alle 5 - 7 Tage.
   Anmerkung: Zellen, die große Otosphären bilden oder sich am Boden der Gewebekulturschale festsetzen, differenzieren sich. Zellen sterben auch ab, wenn die Kulturen überkonfluent sind.

>2. Differenzierung von IMOP-Zellen in sensorische Epithelien

1. Bereiten Sie 50 ml iMOP sensorisches Epithelien-Differenzierungsmedium vor: DMEM/F12, 1X B27 Supplement, 25 μg/ml Carbenicillin. Stellen Sie 50 ml iMOP sensorisches Epithelia-Differenzierungsmedium her. 49 ml DMEM/F12 in einem 50 ml konischen Wasserbad in einem 37 °C warmen Wasserbad erwärmen. 50X B27 Supplement und 100 mg/ml Carbenicillin-Aliquots für 5 min. in einem 37 °C warmen Wasserbad auftauen. 1 ml 50X B27 und 12,5 μl 100 mg/ml Carbenicillin in DMEM/F12 geben.
2. Um Zellen zu ernten, zu dissoziieren, zu resuspendieren und zu zählen, wiederholen Sie die Schritte 1.4-1.9
3. Platte 1 x 10⁶ Zellen in einer 6 cm Schale an Tag -3 mit iMOP-Kulturmedien. Am Tag 0 werden die Kulturen mit einer 10-ml-Pipette in eine konische 15-ml-Pipette überführt. Sammeln Sie die Otosphären durch Schwerkraftsedimentation, wie in Schritt 1.6 beschrieben. Das verbrauchte Medium wird mit einer 2-ml-Aspirationspipette abgesaugt und die Otosphären an der Unterseite des Konischen belassen.
4. Vorsichtig 2 ml sensorisches Epithelia-Differenzierungsmedium zugeben. Übertragen Sie die Otosphären mit einer 10-ml-Pipette mit großem Durchmesser in eine 6-cm-Schale.
   Anmerkung: Mechanisches Scheren durch hartes Pipettieren kann Zellen von den Otosphären dissoziieren.
5. Geben Sie jeden zweiten Tag 2 ml frisches sensorisches Epitheldifferenzierungsmedium in die Kulturen. Bei Bedarf können Zellen durch Schwerkraftsedimentation gesammelt und Medien ausgetauscht werden.
6. Entnehmen Sie die Otosphären an Tag 10, indem Sie sie auf einen konischen 15-ml-Behälter geben und die Otosphären wie in Schritt 1.6 beschrieben sedimentieren lassen. Das verbrauchte Medium wird mit einer 2-ml-Aspirationspipette aspiriert und die Otosphären ungestört gelassen.
7. Fixieren Sie die Otosphären, indem Sie sie 15 Minuten lang bei RT in 4 % Formaldehyd in 1X PBS inkubieren. Entfernen Sie die Formaldehydlösung und waschen Sie die Otosphären mit Waschpuffer (1 x PBS mit 0,1 % TritonX-100), bevor Sie sie 1 Stunde lang in Blockierungspuffer (1 x PBS mit 10 % normalem Ziegenserum und 0,1 % Triton X-100) inkubieren.
   1. Ersetzen Sie den Puffer und inkubieren Sie die Proben in einem Blockierungspuffer mit verdünntem Antikörper. Inkubieren bei 4 °C. Die Proben werden mit 1x PBS mit 0,1 % Triton X-100 gewaschen und die Otosphäre einer Immunfärbung unterzogen. Übertragen Sie Otosphären in 1X PBS und platzieren Sie die Otosphären mit einer P1000-Pipette in Eindeckmedien auf einem Objektträger. Legen Sie ein Deckglas über die Probe und lassen Sie Einbettmedien bei 4 °C trocknen.
8. Erfassen Sie Epifluoreszenzbilder mit einem inversen Mikroskop, das mit einer 16-Bit-CCD-Kamera und einem 20X 0,75 Luft- oder einem 40X 1,3 NA Ölimmersionsobjektiv ausgestattet ist. Erfassen Sie Fluoreszenz aus verschiedenen Farbkanälen mit den aufgeführten Wellenlängen (Anregung und Emission): blau (377 ± 25 nm/447 ± 30 nm), grün (475 ± 25 nm/540 ± 25 nm), rot (562 ± 20 nm/ und 625 ± 20 nm) und Infrarot (628 ± 20 nm/ und 692 ± 20 nm).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 Dicke Glasdeckglas (Rund 12 mm)	Elektronenmikroskopie	Artikel-Nr.: 72230-01
DMEM/F12	Lebenstechnologien	Tel.: 11320-082
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4	Lebenstechnologien	Nr. 10010-023
Hank's Ausgewogene Salzlösung (HBSS)	Lebenstechnologien	Tel.: 14025-092
B27 Ergänzung (50X) Serum frei	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 17504-044	Gelagert als 1 ml Aliquots
Prolong Gold Antifade Eindeckmittel	Lebenstechnologien	Tel.: 47743-736	Gelagert als 10 mg/ml 100 μl Aliquots
Moxi Z Mini Automatisierter Zellzähler	Orflo	MXZ001
Moxi Z Kassette Typ S	Orflo	MXC002
Rekombinanter Maus-Fibroblasten-Wachstumsfaktor, basisch (bFGF)	Peprotech	Nr. 450-33	Resuspendiert in 0,1 % BSA in H20 und gelagert als 20 mg/ml Aliquote
Carbenicillin, Dinatriumsalz	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: BP2648-1	Resuspendiert in 10 mM Hepes pH 7,4 und gelagert als 100 mg/ml Aliquote
5 ml Pipette einzeln verpackt Taschenbuch (200/Karton)	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 1367811D
10 ml Pipette einzeln verpackt Taschenbuch (200/Karton)	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 1367811E
Gewebekultur behandelte 6 cm Schale	Thermo Fisher Scientific	130181
TipOne Filterpipettenspitzen 0,1-10 ul längliche Filterspitze	USA Wissenschaftlich	Tel.: 1120-3810
TipOne Filter Pipettenspitzen 1-20 ul Filterspitze	USA Wissenschaftlich	Nr. 1120-1810
TipOne Filterpipettenspitzen 1-200 ul Filterspitze	USA Wissenschaftlich	Tel.: 1120-8810
TipOne Filterpipettenspitzen 101-1000 ul Filterspitze	USA Wissenschaftlich	Tel.: 1126-7810
15 ml konische Röhrchen steril 20 Beutel à 25 Röhrchen (500 Röhrchen)	USA Wissenschaftlich	Artikel-Nr.: 1475-0511
50 ml konische Röhrchen steril 20 Beutel à 25 Röhrchen (500 Röhrchen)	USA Wissenschaftlich	Nr. 1500-1211