Methodenartikel

Differenzierung immortalisierter multipotenter otischer Vorläuferzellen in spiralförmige Ganglienneuronen und Bewertung der Differenzierung

8. Juli 2025

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Quelle: Azadeh, J., et al. Initiierung der Differenzierung in immortalisierten multipotenten otischen Vorläuferzellen. J. Vis. Exp. (2016).

Das Video zeigt die Differenzierung von immortalisierten multipotenten otischen Vorläuferzellen (iMOPs) in spiralförmige Ganglienneuronen (SGNs) und die Immunfluoreszenz-basierte Bestätigung der Differenzierung. Die iMOPs werden zur Differenzierung in SGNs auf mit Kultursubstrat beschichtete Deckgläser in einem neuronalen Differenzierungsmedium plattiert. Die differenzierten Zellen werden mit Antikörpern markiert, die spezifisch für neuronale Differenzierungsmarker sind, und unter einem Mikroskop analysiert, um die Differenzierung zu bestätigen.

Protokoll

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>1. Unterscheidung von iMOP-abgeleiteten Neuronen

  1. Stellen Sie 50 ml neuronales Differenzierungsmedium her: Neurobasale Medien, 1X B27-Ergänzung, 2 mM L-Glutamin. Flasche mit 50X B27 und 200 mM L-Glutamin in 37 °C Wasserbad für 5 min auftauen. Geben Sie 1 ml 50X B27 und 0,5 ml 200 mM L-Glutamin zu 48,5 ml Neurobasalmedium.
  2. Beschichten Sie das Deckglas, indem Sie 12 mm runde 1,5-Glas-Deckgläser in eine sterile 10-cm-Platte legen und 70 % Ethanol (EtOH) auf die Platte geben, um die Deckgläser zu sterilisieren und zu reinigen.
  3. Rühren Sie die Deckgläser vorsichtig um, um sicherzustellen, dass sie mit Ethanol bedeckt sind. Lassen Sie die Platte 10 Minuten bei RT. Spülen Sie die Deckgläser 3 Mal mit steriler 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aus, um das restliche Ethanol auszuwaschen. Spülen Sie das Deckglas einmal mit sterilem H2O aus, um das restliche 1X PBS auszuwaschen.
  4. Aspirieren Sie das H2O mit einer 2 ml Aspirierpipette und lassen Sie die Deckgläser trocknen. Setzen Sie die Deckgläser 15 Minuten lang in der Gewebekulturhaube UV-Licht aus. Bewahren Sie Deckgläser in einer sterilen Umgebung auf, wenn sie nicht sofort verwendet werden.
  5. Legen Sie ein rundes 12-mm-Deckglas in jede Vertiefung einer 24-Well-Schale. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Deckgläser flach auf dem Boden der Vertiefung aufliegen.
  6. 2 mg/ml Poly-D-Lysin-Stammlösung bei Raumtemperatur (RT) auftauen und auf eine Poly-D-Lysin-Konzentration von 10 μg/ml in 1X PBS verdünnen. 0,25 ml 10 μg/ml Poly-D-Lysin in die Vertiefungen geben. Lassen Sie die Platte 1 Stunde im 37 °C heißen Inkubator.
  7. Waschen Sie die Vertiefungen 3 Mal mit sterilem 1X PBS. 10 mg/ml Laminin-Stammlösung bei RT auftauen und in 1X PBS auf 10 μg/ml verdünnen. 0,25 ml 10 μg/ml Laminin-Arbeitslösung in eine Einzelvertiefung einer 24-Mehrfach-Well-Schale geben. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C Inkubator. Aspirieren Sie die Lamininlösung mit einer 2-ml-Aspirationspipette.
  8. Waschen Sie den Deckglas 3 Mal mit 1X PBS, indem Sie 1 ml 1X PBS mit einer P1000-Pipette hinzufügen und das 1X PBS durch Aspirieren mit einer 2 ml Aspirationspipette entfernen. Lassen Sie 1X PBS von der letzten Wäsche in der Vertiefung, bis die Zellen bereit sind, plattiert zu werden. Initiieren Sie die neuronale Differenzierung, indem Sie Zellen ernten, dissoziieren und zählen. Teller 1 x 106 Zellen in einer 6 cm Schale an Tag -3.
  9. Am Tag 0 werden Zellen geerntet, dissoziiert und gezählt. 1 x 105 - 1,5 x 105 iMOP-Zellen in 0,5 ml vorgewärmtes neuronales Differenzierungsmedium pro Well in einer 24 Multiwell-Schale säen. Aspirieren und fügen Sie den Kulturen jeden zweiten Tag vorgewärmte neuronale Differenzierungsmedien hinzu.
  10. Fixieren Sie iMOP-abgeleitete Neuronen in 4 % Formaldehyd für 15 Minuten bei RT an Tag 7. Entfernen Sie die Formaldehydlösung, waschen Sie iMOP-abgeleitete Neuronen mit Waschpuffer (1X PBS mit 0,1 % TritonX-100), bevor Sie 1 Stunde lang in Blockierungspuffer (1 X PBS mit 10 % normalem Ziegenserum und 0,1 % Triton X-100) inkubieren.
    1. Ersetzen Sie den Puffer und inkubieren Sie die Proben in einem Blockierungspuffer mit verdünntem Antikörper. Inkubieren bei 4 °C. Proben mit 1X PBS mit 0,1 % Triton X-100-Probandzellen zur Immunfärbung waschen. Waschen Sie das Deckglas mit 1X PBS, bevor Sie es auf das Montagemedium aufsetzen. Lassen Sie das Eindeckmedium bei 4 °C trocknen, bevor Sie Epifluoreszenzbilder aufnehmen.

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Offenlegungen

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Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 Dicke Glasdeckglas (Rund 12 mm)Elektronenmikroskopie 7Artikel-Nr.: 72230-01
DMEM/F12LebenstechnologienTel.: 11320-082
Neurobasales MediumLebenstechnologienArtikel-Nr.: 21103
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4LebenstechnologienNr. 10010-023
B27 Ergänzung (50X) Serum freiLebenstechnologienArtikel-Nr.: 17504-044Gelagert als 1 ml Aliquots
L-Glutamin (200 mM)LebenstechnologienArtikel-Nr.: 25030-081Gelagert als 5 ml Aliquots
Natürliches Maus-LamininLebenstechnologienArtikel-Nr.: 23017-015Gelagert als 1 mg/ml Aliquote
Prolong Gold Antifade EindeckmittelLebenstechnologienTel.: 47743-736Gelagert als 10 mg/ml 100 μl Aliquots
Moxi Z Mini Automatisierter ZellzählerOrfloMXZ001
Moxi Z Kassette Typ SOrfloMXC002
Poly-D-LysinSigmaNr. 7886Resuspendiert in 1X PBS und gelagert als 10 mg/ml 100 μl Aliquots
5 ml Pipette einzeln verpackt Taschenbuch (200/Karton)Thermo Fisher ScientificArtikel-Nr.: 1367811D
10 ml Pipette einzeln verpackt Taschenbuch (200/Karton)Thermo Fisher ScientificArtikel-Nr.: 1367811E
Mit Gewebekulturen behandelte Biolite 24-Well-PlatteThermo Fisher Scientific130188
Mit Gewebekulturen behandelte Biolite 6-Well-PlatteThermo Fisher Scientific130184
Gewebekultur behandelte 6 cm SchaleThermo Fisher Scientific130181
EMD Millipore Millex Sterilspritze PVDF Filter Porengröße: 0,22 μmThermo Fisher ScientificSLGV033RS
TipOne Filterpipettenspitzen 0,1 - 10 μl längliche FilterspitzeUSA WissenschaftlichTel.: 1120-3810
TipOne Filterpipettenspitzen 1 - 20 μl FilterspitzeUSA WissenschaftlichNr. 1120-1810
TipOne Filterpipettenspitzen 1 - 200 μl FilterspitzeUSA WissenschaftlichTel.: 1120-8810
TipOne Filterpipettenspitzen 101 - 1000 μl FilterspitzeUSA WissenschaftlichTel.: 1126-7810
15 ml konische Röhrchen steril 20 Beutel à 25 Röhrchen (500 Röhrchen)USA WissenschaftlichArtikel-Nr.: 1475-0511
50 ml konische Röhrchen steril 20 Beutel à 25 Röhrchen (500 Röhrchen)USA WissenschaftlichNr. 1500-1211
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