Alle Tiermodellverfahren wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss überprüft und das JoVE Veterinärprüfungsgremium hat alle Tiermodellverfahren überprüft.
>1. Zeitgesteuerte Paarungen
- Place ISLMN:GFP (Insel-Motoneuron, grün fluoreszierendes Protein; MGI: J:132726; Jax Tg(Isl-EGFP*)1Slp/J Bestands-Nr.: 017952) männliche und weibliche Mäuse über Nacht zusammen gezüchtet. Wiegen Sie die Weibchen und notieren Sie die Gewichte vor der Paarung.
HINWEIS: ISLMN:GFP markiert Motoneuronen spezifisch mit einem farnesylierten GFP, das nicht zytotoxisch ist, an der Zellmembran von Motoneuronen und ihren Axonen lokalisiert ist und die Visualisierung der Nerven während der Entwicklung ermöglicht. Es könnten auch andere fluoreszenzmarkierte Linien verwendet werden.
- Überprüfen Sie am frühen Morgen auf Vaginalpfropfen. Das Datum, an dem ein Stecker identifiziert wird, wird als E0.5 bezeichnet.
- Die Schwangerschaft wird durch Gewichtszunahme und/oder Ultraschall am Embryonaltag 10.5 bestätigt (E10.5). Trächtige Hündinnen sollten mindestens 1 g zugenommen haben. Embryonen können im Ultraschall bei E10.5 gesehen werden.
2. Vorbereitung von Reagenzien und Vibratomen für die Scheibenkultur
- Bereiten Sie 500 ml Schnittpuffer vor: Fügen Sie 5 ml HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure) und 5 ml Penicillin/Streptomycin zu 500 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Ca2+ und Mg2+ hinzu. Kühl auf 4 °C.
Anmerkung: Zusätzlicher Schneidepuffer sollte bei 4 °C gelagert werden und kann für zukünftige Schnittkulturexperimente verwendet werden.
- Bereiten Sie 50 ml Nährmedium vor: Geben Sie in einer sterilen Haube 12,5 ml HBSS, 12,5 ml fötales Rinderserum (FBS), 250 μl Glukose, 250 μl L-Glutamin, 125 μl HEPES zu 24,4 ml Fluorobright DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium). (Endkonzentrationen: FlouroBright DMEM mit 25 % HBSS, 25 % FBS, 0,5 % Glukose, 1 mM Glutamin und 2,5 mM HEPES). Erwärmen Sie den Nährboden in einem sterilen Wasserbad auf 37 °C.
Anmerkung: Nährmedien können bis zu 3 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
- Geben Sie in einer sterilen Haube 1,5 ml Nährmedium in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Fügen Sie jeder Vertiefung einen Zellkultureinsatz (Materialtabelle) hinzu. In einen sterilen Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 stellen.
- Bereiten Sie 4 % Agarose mit niedriger Schmelztemperatur vor: Lösen Sie 2 g Agarose mit niedriger Schmelztemperatur in 50 ml sterilem PBS. Mikrowelle in Abständen von 30-60 s, bis es sich vollständig aufgelöst hat. In ein 40 °C warmes Wasserbad stellen, um die Flüssigkeit zu halten.
Anmerkung: Zusätzliche Agarose kann bei Raumtemperatur (RT) gelagert und für zukünftige Schnittkulturexperimente geschmolzen werden.
- Vibratom einrichten: Platzieren Sie eine neue Klinge auf Vibratome. Überprüfen Sie die Einstellungen: Dicke 400-450 μm. Kühle die Vibratomus-Stufe vor. Lege etwas Eis in die äußere Kammer. Verwenden Sie eine Kammer und eine Bühne, die für Live-Slices vorgesehen sind. Verwenden Sie nicht die gleiche Vibratomkammer für fixiertes Gewebe, da Restfixiermittel die Scheiben beschädigen können.
- Bereiten Sie den oberen Inkubator des Mikroskoptisches auf 37 °C und 5 % CO2 vor.
- Vorbereitung für die Dissektion: Chirurgische Instrumente reinigen und mit 70% Ethanol besprühen. Zwei Petrischalen mit HBSS füllen, auf Eis legen. Öffnen Sie eine 12-Well-Gewebekulturplatte und legen Sie den Deckel mit der Unterseite nach oben auf Eis. Öffnen Sie eine 6-Well-Gewebekulturplatte und legen Sie die Zellkulturmembraneinsätze und 1,5 mL Zellkulturmedien in jede Well. Die Platte in einem 37 °C und 5 % CO2 -Inkubator vorwärmen.
>3. Entnahme von E10.5-Embryonen und Vorbereitung von Schnitten
HINWEIS: Alle Schritte ab diesem Punkt sollten so schnell wie möglich durchgeführt werden. Halten Sie die Embryonen immer auf Eis.
- Das trächtige Muttertier (E10.5) wird in einer CO2 -Kammer eingeschläfert. Führen Sie eine Gebärmutterhalsluxation durch.
- Besprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol. Schneiden Sie den Bauch mit einer Schere auf, entfernen Sie die Gebärmutter und legen Sie sie in eine Petrischale mit eiskaltem HBSS, um das Blut schnell wegzuspülen. Bringen Sie die gewaschene Gebärmutter in einen zweiten Petri, der mit eiskaltem HBSS gefüllt ist.
- Entnehmen Sie unter einem Präpariergerät die Embryonen aus dem Gebärmutterhorn und den einzelnen Fruchtblasen. Platzieren Sie die Embryonen auf der Unterseite des Deckels einer 12-Well-Platte. Bleiben Sie auf Eis.
- Verwenden Sie unter einem Präpariergerät Filterpapier, um die Flüssigkeit zu entfernen, die jeden Embryo umgibt.
Anmerkung: Embryonen kleben am Filterpapier, wenn sie berührt werden.
- Betten Sie Embryonen in Agarose ein. Gießen Sie geschmolzene Agarose über jeden Embryo, um ihn zu bedecken. Bleiben Sie auf Eis. Sobald die Agarose ausgehärtet ist, drehen Sie jeden Embryo um und gießen Sie zusätzliche Agarose auf die andere Seite. Bleiben Sie auf Eis.
- Schneiden Sie die Agarose mit einem fluoreszierenden Präpariergerät um jeden Embryo herum, damit sie richtig ausgerichtet ist, wenn sie auf das Vibratomstadium geklebt wird. Der okulomotorische Kern und das frühe Axonwachstum sind fluoreszierend. Richten Sie den Embryo so aus, dass der Kern, die herausgewachsenen Axone und das Auge eine Linie bilden, und schneiden Sie die Agarose mit einer Rasierklinge ab, die parallel zu dieser Linie geschnitten ist (dorsal zum Embryo, siehe Abbildung 1A).
Anmerkung: Dies ist die Seite, die mit dem Vibratomstadium verklebt ist (der Embryo wird auf dem Rücken positioniert, der Kopf am nächsten an der Vibratomklinge). Eine Linie zwischen dem okulomotorischen Kern und dem Auge sollte parallel zur Vibratomklinge verlaufen.
- Füllen Sie die Vibratomenkammer mit eiskaltem Scheibenpuffer. Kleben Sie den Embryo mit Sekundenkleber auf das Vibratomstadium, so dass die Klinge parallel zum okulomotorischen Kern und den Augen ist. Sobald der Sekundenkleber trocken ist, tauchen Sie das Vibratomstadium ein, so dass der Embryo mit dem Gesicht zur Klinge weg ausgerichtet ist.
- Scheiben von 400-450 μm schneiden. Sammeln Sie jede Scheibe mit einer sterilen Transferpipet. In den Kaltschnittpuffer geben.
- Wählen Sie unter dem Präparierbereich die Schicht aus, die die okulomotorischen Kerne und Augen enthält. Legen Sie es mit einer sterilen Transferpipette auf den Zellkultureinsatz in der 6-Well-Platte. Stellen Sie die Platte wieder in den 37 °C heißen Inkubator. Alternativ können Sie eine Person in Scheiben schneiden und eine andere Person die Scheiben platzieren lassen. Minimieren Sie die Zeit zwischen dem Schneiden und dem Einlegen in den Inkubator.
Anmerkung: Die Schichten sollten so ausgerichtet werden, dass die maximale Fluoreszenz, die von den Kernen und Axonen emittiert wird, dem Objektiv des bildgebenden Mikroskops am nächsten ist. Bei einem inversen Mikroskop sollten die Scheiben auf der Membran platziert werden, wobei die Kerne und Axone dem Objektiv am nächsten unter der Platte liegen.
- Entfernen Sie die restliche Agarose aus dem Vibratomstadium, kleben Sie den nächsten Embryo mit Sekundenkleber auf das Stadium und wiederholen Sie die Schritte 3.7-3.9, bis alle Embryonen geschnitten und plattiert wurden.
- Fügen Sie den Medien in jeder Vertiefung einen Inhibitor oder ein rekombinantes Molekül Ihrer Wahl hinzu, um eine Dosis-Wirkungs-Kurve zu erstellen. In geeignetem Lösungsmittel verdünnen.
Anmerkung: Wenn Sie Dimethylsulfoxid (DMSO) verwenden, verwenden Sie nur DMSO in Gewebekulturqualität. Alternativ können proteinfreisetzende Kügelchen an bestimmten Stellen auf der Scheibe platziert werden.
- Stellen Sie das Mikroskop in die 37 °C und 5 % CO2 -Kammer. Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass alle 30 Minuten (oder bei Bedarf häufiger) Phasenkontrast- und Fluoreszenzfotos jeder Schicht aufgenommen werden. Die Scheiben können 48-72 h lang aufbewahrt werden.
