Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.
1. Vorbereitung von Instrumenten, Lösungen und Medien
Hinweis: Alle Informationen über Materialien, Reagenzien, Werkzeuge und Instrumente, die im Protokoll gemeldet werden, sind in der Materialtabelle angegeben.
- Autoklavieren Sie alle Präparierinstrumente und lagern Sie sie in einem sterilen Bereich. Verwenden Sie für die Dissektion folgende Instrumente: 4 Standardpinzetten (2 lange und 2 kurze) und 2 Scheren sowie 2 Pinzetten (1 lange und 1 kurze) und 1 Schere; Bewahren Sie ein zusätzliches Set als Backup auf.
- Bereiten Sie 100 ml sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) / 1 % fötales Rinderserum (FBS) für die Verwendung bei Waschvorgängen, Immunmarkierungsverfahren und Zellsortierschritten vor. Die Lösung bei 4 °C abkühlen lassen.
Anmerkung: Fügen Sie der Lösung kein Natriumazid (NaN3) hinzu, da es für lebende Zellen giftig sein kann.
- Bereiten Sie 100 mL PBS/1% FBS mit 99 mL PBS und 1 mL FBS vor.
- Bereiten Sie 100 ml steriles neurales Zellmedium vor, das mit 3 % FBS (siehe Materialtabelle) ergänzt wird, zur Verwendung als Entnahme- und Kulturmedium. Halten Sie das Zellkulturmedium steril bei 4 °C. Erwärmen Sie es nur vor der Verwendung auf Raumtemperatur (RT).
- Bereiten Sie 100 ml Nervenzellmedium vor, ergänzt mit 3 % FBS, unter Verwendung von 97 ml Nervenzellmedium und 3 ml FBS.
- Pre-Chill-Sammelröhrchen (15-ml-Röhrchen), die mit 5 mL Sammelmedium vorbeschichtet sind, indem sie in einen Eiskübel gelegt werden. Verwenden Sie nur Polypropylen-Röhrchen, um zu verhindern, dass die Zellen an der Röhrchenoberfläche haften.
- Stellen Sie 40-mm-Schalen, 70-μm-Nylonsiebe, Spritzen, Stößel für das Zellsieb und sterile Polypropylenröhrchen in die Biosicherheitswerkbank. Sterilisieren Sie alle Gegenstände vor den Eingriffen und halten Sie sie während des gesamten Eingriffs steril.
Anmerkung: Alle Schritte nach der Entnahme der Netzhaut werden in der Biosicherheitswerkbank durchgeführt.
2. Vorbereitung der Retinalzellsuspension
- Platzieren Sie das gesammelte Auge auf der Grundplatte eines Dissektionsmikroskops, um mit der Hornhautdissektion zu beginnen. Präpariere jedes Auge einzeln.
- Halten Sie den Globus vorsichtig mit einer Pinzette an der Basis des Sehnervs. Verwenden Sie für diesen Schritt eine lange und eine kurze Standardzange.
- Verwende eine 30G scharfe Nadel, um die Hornhaut zu durchstechen. Dadurch kann das Kammerwasser aus dem Auge entweichen, was es einfacher macht, das Auge mit der Pinzette zu halten.
- Halten Sie die Hornhaut mit der Pinzette fest und machen Sie mit einer Schere einen kleinen Schnitt in die Hornhaut. Schälen Sie die Hornhaut und Sklera vorsichtig mit der Pinzette. Wenn der Globus halb geschält ist, rollen Sie die Netzhaut und die Linse mit der Pinzette heraus. Entsorgen Sie die Hornhaut, die Sklera und die Linse.
Anmerkung: Diese Methode sorgt dafür, dass sich die Netzhaut vollständig vom Rest des Auges löst.
- Legen Sie die Netzhaut in eine kleine 40-mm-Petrischale, die PBS/1 % FBS enthält.
Anmerkung: Als Alternative zur Petrischale kann eine Zellkulturschale verwendet werden. Achten Sie darauf, die Netzhaut immer feucht zu halten, wie unter physiologischen Bedingungen.
- Waschen Sie jede Netzhaut dreimal mit frischem sterilem PBS/1% FBS in der Biosicherheitswerkbank.
- Legen Sie bis zu 12 Retinae auf ein steriles 70-μm-Nylonsieb, das mit PBS/1 % FBS angefeuchtet ist. Mazerieren Sie die Netzhaut mit dem hinteren Ende einer 10-ml-Spritze vorsichtig mit kreisenden Bewegungen, um die Zellen abzulösen.
- Alternativ können Sie einen Stößel für die Mazeration des Zellsiebs verwenden oder einen enzymatischen Aufschluss mit einer Kombination aus 15 I.E./ml Papain, 5 mM L-Cystein und 200 U/mL DNase I für 15 min bei 37 °C verwenden, gefolgt von einer Inaktivierung mit PBS/10 % FBS.
Anmerkung: Es wurden keine Veränderungen im Prozentsatz der zurückgewonnenen Zellen beobachtet, wenn der enzymatische Verdau mit der Mazeration mit dem hinteren Ende der Spritze oder dem Stößel verglichen wurde.
- Um die isolierten Zellen zu übertragen, legen Sie das sterile 70-μm-Nylonsieb über das Polypropylen-Entnahmeröhrchen. Führen Sie die gesammelten Zellen mit einer P1000-Pipette durch das Sieb. Spülen Sie das Sieb (Schritt 3.6) mit PBS/1 % FBS, um alle verbleibenden Zellen freizusetzen und in das Sammelröhrchen zu überführen.
- Fügen Sie PBS/1% FBS hinzu, um ein endgültiges Volumen von 1 ml pro Netzhaut zu erreichen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 7 min bei 200 x g und RT.
Hinweis: Abhängig von der Anzahl der mazerierten Netzhaut (< 6 Netzhaut) kann das Zellpellet zu klein sein, um sichtbar zu sein.
- Verwerfen Sie den Zellüberstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in PBS/1% FBS mit einem Verhältnis von 1 ml pro 5 Retinae.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
- Reinigen Sie ein Hämozytometer und Deckglas aus Glas mit 70% Alkohol. Schwenken Sie das Röhrchen mit den Zellen vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Suspension der Netzhautzellen gleichmäßig verteilt ist. 20 μl 0,4 % Trypanblau in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben und mit 20 μl der Zellsuspension mischen.
- Vorsichtig mischen und 10 μl des 0,4%igen Trypanblau/Zellsuspensionsgemisches auf das Hämozytometer geben, wobei beide Kammern gefüllt werden; durch Kapillarwirkung wird das 0,4%ige Trypanblau/Zellsuspensionsgemisch unter das Deckglas gezogen. Zählen Sie mit einem Mikroskop alle trypanblau-negativen Zellen; Diese Zahl steht für die lebenden Zellen.
- Bestimmen Sie die Zellviabilität mit der folgenden Formel: Lebendzellzahl / Gesamtzellzahl = % Viabilität.
Anmerkung: Wenn die Lebensfähigkeit der Zellen weniger als 95 % beträgt, ist ein Fluoreszenzfarbstoff erforderlich, um die Zellviabilität während der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) zu unterscheiden.
- Verwenden Sie einen fluoreszierenden Viabilitätsfarbstoff, der nicht für lebende Zellen verwendet werden kann. Waschen Sie die Zellen mit PBS, um alle Spuren von Serum zu entfernen. Fügen Sie 1 μl Fluoreszenzfarbstoff zur Unterscheidung der Zellviabilität pro 5,0 x 106 Zellen in einem Endvolumen von 100 μl hinzu. 15 min bei RT lichtgeschützt inkubieren. Fügen Sie das 10-fache des Volumens von PBS/1% FBS hinzu. 5 min bei 200 x g und RT zentrifugieren.
- Falls erforderlich, die Zellsuspension über Nacht bei 4 °C inkubieren. Wenn dies geschehen ist, füllen Sie das Zellsuspensionsröhrchen mit Nervenzellmedium anstelle von PBS/1% FBS. Stellen Sie das Rohr waagerecht auf und halten Sie es bei 4 °C.
3. Immunmarkierung der Netzhautzellen
- Verwenden Sie die folgende Umrechnung, um das Volumen des Antikörpers pro Zellzahl zu bestimmen: 2 μl Antikörper pro 5,0 x 106 Zellen in einem Volumen von 100 μl.
- Waschen Sie die Zellen und halten Sie sie in PBS/1% FBS. Nehmen Sie ein kleines Aliquot von Zellen (5,0 x 106 Zellen), um es als Negativkontrolle (unbeschriftet) zum Zeitpunkt der Sortiereinrichtung zu verwenden.
Anmerkung: Diese Negativkontrolle ist entscheidend für die korrekte Kalibrierung des Zellsortierers.
- Um die unspezifische Bindung von Antikörpern an Zellen, die die Fcγ-Rezeptoren II und III exprimieren, zu minimieren, fügen Sie 1 μl eines Anti-Maus-CD16/32-Antikörpers pro 1,0 x 106 Zellen in einem 50-μl-Endvolumen unter Verwendung von PBS/1% FBS hinzu. 10 Minuten bei RT inkubieren.
- Geben Sie den Antikörpercocktail in die Probe und mischen Sie ihn vorsichtig durch Pipettieren. 30 min in einem Eiskübel inkubieren. Stellen Sie sicher, dass der Eiskübel abgedeckt ist, da Licht das Experiment aufgrund der Photobleiche der markierten Fluorophore beeinträchtigen könnte.
- Bereiten Sie den Antikörpercocktail mit den folgenden fluoreszenzmarkierten Anti-Maus-Antikörpern vor: CD90.2 AF (Alexa Fluor)-700, CD48 PE (Phycoerythrin)-Cyanin7, CD15 PE und nicht markiertes CD57.
Hinweis: Für jeden Antikörper sind die folgenden Konzentrationen pro 5,0 x 106 Zellen zu verwenden: CD90,2 AF700, 1 μg; CD48 PE-Cyanin7, 0,4 μg; CD15 PE, 0,02 μg; und unmarkiertes CD57, 0,4 μg.
- Die Volumina werden gemäß den folgenden Berechnungen verwendet (basierend auf den in der Materialtabelle aufgeführten kommerziell erhältlichen Antikörpern): insgesamt 5,0 x 107 zu markierende Zellen; 2 μl pro 5,0 x 106 Zellen = 20 μl jedes Antikörpers; 4 verschiedene Antikörper = 80 μl Antikörpercocktail; Endvolumen = [(5,0 x 107 Zellen insgesamt)/5,0 x 106 Zellen] x 100 = 1.000 μL; 80 μl Abs + 50 μl Anti-Maus-CD16/32 + 870 μl PBS/1 % FBS = 1.000 μl.
Anmerkung: Diese Kombination lieferte die optimale Kombination von Fluorochromen für die Instrumentenkonfiguration. Die folgenden Parameter fassen die Emission und Anregung zusammen: AF-700, Emission von 719 nm bei Anregung mit einem 638-nm-Rotdiodenlaser; PE-Cyanin7, Emission von 767 nm bei Anregung mit einem 488 nm blauen Diodenlaser; und PE, Emission von 575 nm bei Anregung mit einem 488-nm-Laser mit blauer Diode.
- Nach der 30-minütigen Inkubation erhöhen Sie das Volumen mit PBS/1 % FBS auf bis zu 5 ml. Waschen Sie die Proben, indem Sie sie 7 Minuten lang bei 200 x g und RT zentrifugieren. Wiederholen Sie den Vorgang einmal, um alle ungebundenen Antikörper zu entfernen.
- Fügen Sie 2 μl Sekundärantikörper (0,1 μg) hinzu, der das CD57 von 5,0 x 106 Zellen bindet. 30 Minuten in einem Eiskübel inkubieren, wie in Schritt 3.4 beschrieben. Waschen Sie die Zellen zweimal, wie in Schritt 3.5.
- Markieren Sie die Zellen mit einem Sekundärantikörper, wenn in Schritt 3.4.
ein nicht markierter Primärantikörper verwendet wurde.
Hinweis: Der Sekundärantikörper der Wahl für diese Konfiguration ist in der Materialtabelle aufgeführt. Es hat eine Emissionswellenlänge von 421 nm. Verwenden Sie es mit einem Bandpassfilter von 450/50 nm, wenn es mit dem violetten Diodenlaser bei 405 nm angeregt wird.
- Verwenden Sie Volumina gemäß den folgenden Berechnungen (basierend auf den in der Materialtabelle aufgeführten kommerziell erhältlichen Antikörpern): 2 μl pro 5,0 x 106 Zellen = 20 μl Sekundärantikörper; Endvolumen = [(5,0 x 107 Zellen)/5,0 x 106 Zellen] x 50 = 500 μl; 20 μl Abs + 480 μl PBS/1 % FBS = 500 μl.
- Behalten Sie die markierten Zellen in PBS/1% FBS. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer; Verwenden Sie eine Endkonzentration der retinalen Zellen von 3,0 - 4,0 x 107 Zellen/ml.
Anmerkung: Verwenden Sie kein Zellkulturmedium, um die Zellen zu verdünnen, da das Phenolrot die Autofluoreszenz erhöhen und dadurch die Auflösung zwischen negativen und positiven Zellen verringern kann. Die endgültige Zellkonzentration pro Volumen hängt stark von der Volumenstromrate der Gerätekonfiguration ab.
- Verwenden Sie während der Einrichtung einfarbige Steuerelemente, um Fluoreszenz-Spillover zu minimieren.
Anmerkung: Dieser Schritt, der auch als Kompensation bezeichnet wird, wird angewendet, um das durch die Kombination von Fluorophoren erzeugte Rauschen zu korrigieren. Polystyrol-Mikrosphären in PBS/0,1 % BSA/2 mM NaN3 mit der Fähigkeit, fluoreszenzmarkierte Immunglobulin (Ig)-Isotypen aus mehreren Spezies zu binden, bieten Positivkontrollen zur Einstellung der Kompensation.
- Geben Sie 3 Tropfen der Polystyrol-Mikrosphären in sterile FACS-Röhrchen und teilen Sie einem pro Fluorophor einen zu. Geben Sie 1 μg des jeweiligen Fluorophors in jedes Röhrchen. 15 min bei RT lichtgeschützt inkubieren. Geben Sie 3 mL PBS/1 % FBS in die Probenröhrchen. 5 min bei 200 x g und RT zentrifugieren. Den Überstand vorsichtig entfernen und in 250 μl PBS/1 % FBS resuspendieren.
- Verwenden Sie zum Einrichten der Negativkontrollen Polystyrol-Mikrosphären, die nicht an Ig binden. Führen Sie diesen Schritt bei Bedarf am Vortag durch.