Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
Sowohl C57BL/6-Mäuse als auch Fpr-rs3-i-Venus-Mäuse wurden in Gruppen beiderlei Geschlechts bei Raumtemperatur in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus untergebracht, wobei Nahrung und Wasser ad libitum zur Verfügung standen. Für die Experimente wurden junge Erwachsene (6-20 Wochen) beiderlei Geschlechts verwendet. Es wurden keine offensichtlichen geschlechtsabhängigen Unterschiede beobachtet.
>1. Vorbereitung der Lösung
- Extrazelluläre Lösung S1 herstellen: 4-(2-Hydroxy-ethyl)piperazin-1-ethansulfonsäure (HEPES) gepufferte extrazelluläre Lösung, die (in mM) 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES; pH = 7,3 (angepasst mit NaOH); Osmolarität = 300 mOsm (angepasst mit Glukose).
- Extrazelluläre Lösung S2 herstellen: Carbogen-sauerstoffhaltige (95 % O2, 5 % CO2) extrazelluläre Lösung, die (in mM) 125 NaCl, 25 NaHCO3, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgSO4, 5 BES (Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure); pH = 7,3; Osmolarität = 300 mOsm (angepasst mit Glukose).
- Bereiten Sie 4 % Agaroselösung mit niedriger Geliertemperatur (S3) für die Gewebeeinbettung vor: Agarose mit 4 % niedriger Geliertemperatur. 2 g niedrig gelierende Agarose in 50 ml S1 in einer 100 ml Laborglasflasche zusammen mit einem Magnetrührer auflösen. Um die Agarose zu schmelzen, stellen Sie die Flasche für ca. 20 min in ein Wasserbad (mit nicht fest geschlossenem Deckel) bei 70 °C oder bis die Lösung unter Rühren transparent wird. Abkühlen lassen und geschmolzene Agarose bis zur weiteren Verwendung in einem zweiten Wasserbad bei 42 °C aufbewahren.
- Intrazelluläre Lösung S4 herstellen: Pipettenlösung mit (in mM) 143 KCl, 2 KOH, 1 EGTA (Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N′,N′-TETRAESSIGSÄURE), 0,3 CaCl2 (freies Ca2+ = 110 nM), 10 HEPES, 2 MgATP (Magnesiumadenosin-5'-triphosphat), 1 NaGTP (Guanosin-5′-triphosphat-Natriumsalzhydrat); pH = 7,1 (angepasst mit KOH); Osmolarität = 290 mOsm.
- Modifizieren/Anpassen der Zusammensetzung von S1, S2 und S4 entsprechend dem individuellen Versuchsdesign (z. B. Verwendung pharmakologischer Blocker, um bestimmte Arten von spannungsaktivierten Strömen zu isolieren).
>2. Vorbereitung des Arbeitsbereichs
- Füllen Sie die Aufbewahrungskammer der sauerstoffhaltigen Scheibe mindestens 30 Minuten vor der Dissektion mit S2, legen Sie die Scheibe zur Temperatur- und pH-Einstellung auf Eis und sauerstoff Sie die Lösung kontinuierlich mit Sauerstoff.
- Füllen Sie das Reservoir für die Slice-Superfusion am Aufnahmeaufbau mit S2 und versorgen Sie es kontinuierlich mit Sauerstoff.
- Füllen Sie vor dem Sezieren die Vibrationskammer mit S2 und verteilen Sie Crushed Ice um die Kammer. Alternativ können Sie die überschüssige, eiskalte sauerstoffhaltige Lösung aus der Sauerstoffkammer in die Vibrationskammer umfüllen und kontinuierlich mit Sauerstoff versorgen.
- Ordnen Sie chirurgische Instrumente und Verbrauchsmaterialien an.
- Legen Sie die Eisgelpackung unter das Präpariermikroskop und decken Sie sie mit einem Papiertuch ab, um zu verhindern, dass das VNO-Gewebe am Boden der Schale festfriert.
- Reinigen Sie die Rasierklinge, indem Sie sie kurz mit 70 % Ethanol und destilliertem Wasser abspülen und dann auf das Vibratom montieren. Ersetzen Sie es für jede Slicing-Sitzung.
>3. VNO-Dissektion und Einbettung
- Opfern Sie das Tier, indem Sie es kurzzeitig CO2 ausgesetzt haben, und enthaupten Sie es mit einer scharfen chirurgischen Schere. Anmerkung: Da die Zeit vom Opfern des Tieres bis zum Eis der VNO-Kapsel entscheidend ist, minimieren Sie die Zeit auf weniger als 2 Minuten. Um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten, betten Sie beide vollständig präparierten VNOs in weniger als 30 Minuten in Agarose ein.
- Entfernen Sie den Unterkiefer mit einer großen chirurgischen Schere. Treten Sie durch die Mundhöhle ein und schneiden Sie die Unterkieferknochen und Muskeln jeder Seite separat ab.
- Lege den restlichen Teil des Kopfes kopfüber in die große Petrischale.
- Ziehen Sie die Haut des Oberkiefers und um die Nasenspitze herum mit einer mittleren Pinzette ab, um einen besseren Zugang zu den Schneidezähnen zu erhalten.
- Schneiden Sie mit einer Knochenschere den größten Teil der Schneidezähne in einem Winkel von ~45° in rostraler Richtung ab (Abbildung 1A). Dies erleichtert die Entfernung der VNO-Kapsel aus der Nasenhöhle.
Anmerkung: Schneiden Sie nicht bis zur Zahnwurzel, um eine Beschädigung der Spitze der VNO-Kapsel zu vermeiden.
- Fassen Sie den starren oberen Gaumen an seinem rostralen Teil mit einer mittleren Pinzette und schälen Sie ihn vorsichtig in einem Stück in einem flachen Winkel zurück (Abbildung 1B).
Anmerkung: Wiederholt mit eiskaltem S2 nachspülen.
- Schneide mit einer Mikrofederschere die knöcherne Verschmelzung zwischen der Spitze des Vomerknochens und dem Kiefer durch. Führen Sie die Scherenspitzen mit dem gebogenen Teil der Spitze nach außen weg vom VNO ein und schneiden Sie den Knochen vorsichtig in kleinen Schritten sowohl auf der linken als auch auf der rechten Seite seitlich der VNO-Kapsel ein.
- Um die VNO-Kapsel zu entfernen, schneiden Sie mit einer Mikrofederschere den Vomerknochen im kaudalen Teil durch und heben Sie ihn vorsichtig mit einer mittleren Pinzette aus der Nasenhöhle. Übertragen Sie das VNO sofort in eine kleine Petrischale unter einem Stereomikroskop auf einem Eisgelpack, wo die restlichen Schritte der Dissektion durchgeführt werden.
- Spülen Sie das VNO in einer kleinen Menge eiskaltem S2 aus, um ein Austrocknen des Gewebes zu verhindern.
- Trennen Sie die knorpeligen Kapseln, die die VNO-Weichteile enthalten, indem Sie mit einer mittleren Pinzette nach der Rückseite des Vomerknochens greifen. Positionieren Sie die Kapsel für eine dorsale Ansicht, so dass eine Teilung zwischen beiden VNOs sichtbar wird (Abbildung 1Di).
- Trennen Sie mit der Spitze einer feinen Pinzette beide Knorpel-VNO-Kapseln vom zentralen Knochen, während der Vomerknochen im hinteren Teil festgesteckt bleibt.
Anmerkung: Verwenden Sie eine Pinzette nur am Rand der Knorpelkapsel und achten Sie sehr darauf, den Knorpel nicht zu durchstechen, da das empfindliche sensorische Epithel leicht beschädigt werden kann.
- Sobald die beiden VNOs getrennt sind, beginnen Sie mit dem Entfernen des Knorpels, der den ersten VNO umschließt.
- Fassen Sie mit einer feinen Pinzette den oberen Rand der Kapsel und spalten Sie die Knorpelwand ab, die zuvor am Vomerknochen (mediale Seite) befestigt war.
- Um den restlichen Knorpel zu entfernen, drehen Sie den VNO mit seiner gebogenen Seitenseite zum Boden der Schale und stecken Sie den Knorpel auf einer Seite mit einer Pinzette fest fest. Bewegen Sie die zweite feine Pinzette vorsichtig von der Rückseite in einem sehr flachen Winkel zwischen Knorpel und VNO, um die Verbindung zwischen Gewebe und Knorpel zu lockern.
- Um eine Beschädigung des sensorischen Epithels zu vermeiden, schälen Sie das VNO langsam vom Knorpel ab, indem Sie es an seiner kaudalen Spitze halten.
- Sobald das VNO aus der Kapsel gehebelt ist, entfernen Sie alle verbleibenden kleinen Knorpelteile. Verbleibende Knorpelstücke lösen das Gewebe während des Schneidevorgangs von der umgebenden Agarose.
- Geben Sie einen kleinen Tropfen eiskaltes S2 auf das erste präparierte VNO, um Gewebeschäden zu vermeiden. Auf der lateralen Seite wird ein großes Blutgefäß sichtbar, das darauf hinweist, dass das Organ noch intakt ist und bei der Dissektion nicht grob geschädigt wurde. Falls das Blutgefäß beschädigt wurde, lohnt es sich trotzdem, mit dem Schneiden des VNO fortzufahren, solange die Gesamtmorphologie nicht eindeutig beeinträchtigt wurde.
- Zerlegen Sie sofort den zweiten VNO.
- Zum Einbetten der VNOs werden die beiden kleinen Petrischalen bis zum Rand mit geschmolzenem S3 gefüllt (im Wasserbad bei 42 °C gelagert; siehe 1.3).
- Halten Sie das VNO mit einer feinen Pinzette am breiteren kaudalen Ende, um eine Schädigung des sensorischen Epithels zu vermeiden.
- Tauchen Sie das VNO in die Agarose und bewegen Sie es mehrmals horizontal hin und her, um den Film der extrazellulären Lösung sowie eventuelle Luftblasen von seiner Oberfläche zu entfernen.
- Positionieren Sie den VNO senkrecht, wobei die Schwanzspitze zum Boden der Schale zeigt. Anstatt den VNO direkt mit der Pinzette einzuklemmen, bewegen Sie die Pinzettenspitze in unmittelbarer Nähe des VNO, um die Ausrichtung einzustellen.
Anmerkung: Die Orientierung während der Einbettung ist entscheidend, da sie die Schnittebene und die Zugänglichkeit zu sensorischen Neuronen während des Experiments bestimmt.
- Teller auf einen Gel-Eisbeutel legen und warten, bis die Agarose fest geworden ist.
Anmerkung: Ändern Sie die VNO-Ausrichtung nicht, sobald sich die Agarose verfestigt hat, da sich dadurch das Gewebe von der umgebenden Agarose löst .
>4. Koronales VNO-Gewebeschneiden
- Mit einem kleinen Spatel den Agaroseblock aus der kleinen Schale in den Deckel einer großen Petrischalen entfernen. Drehen Sie die Agarose auf den Kopf, wobei die kaudale Spitze des VNO nach oben zeigt.
- Schneiden Sie den Block mit einem chirurgischen Skalpell pyramidenförmig (3-4 mm an der Spitze, 8-10 mm an der Unterseite). Achten Sie darauf, das eingebettete Gewebe nicht zu beschädigen.
- Befestigen Sie den pyramidenförmigen Block mit Sekundenkleber in der Mitte der Vibrationsprobenplatte und warten Sie ~1 min, bis der Kleber vollständig getrocknet ist.
- Übertragen Sie die Probenplatte in die Schneidekammer und bereiten Sie den zweiten VNO entsprechend vor. Bewahren Sie eine Platte mit der zweiten Probe bis zur Verwendung bei 4 °C auf.
- Verwenden Sie ein Mikrotom mit vibrierender Klinge mit folgenden Einstellungen: Dicke: 150-200 μm; Geschwindigkeit: 3,5 a.u. = 0,15 mm/sec; Frequenz: 7,5 a.u. = 75 Hz. Übertragen Sie die Schichten bis zur Verwendung in eine sauerstoffhaltige Kammer, nachdem Sie die Scheibenmorphologie unter dem Präpariermikroskop kurz untersucht haben. Die Scheiben können mehrere Stunden aufbewahrt werden.
