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Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
HINWEIS: Kurz gesagt, Fibroblasten wurden durch mRNA-basierte genetische Reprogrammierung zu iPSC umprogrammiert. Die iPSCs wurden in Stammzellmedium (SCM) (siehe Materialliste) gehalten und bei einer Dichte von ~1,2 x 102 Zellen/ml mit 1 ml SCM, 10 μM mit rho-assoziiertem Proteinkinase-Inhibitor (ROCKi) Y-27632 und 10 % (v/v) Dimethylsulfid (DMSO) in kryokonservierten Fläschchen in flüssigem Stickstoff bei -160 °C gelagert. Alle folgenden Verfahren werden, sofern nicht anders angegeben, in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt.
>1. Verdünnung der Basalmembranmatrix und Plattenbeschichtung
- Verdünnte (1:50) Wachstumsfaktor-reduzierte Basalmembranmatrix, gereinigt aus Engelbreth-Holm-Swarm-Tumor in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ohne Phenolrot.
- Beschichten Sie die Zellkulturplatten mit der entsprechenden Menge verdünnter Basalmembranmatrix (d. h. 6-Well-Platte = 1 ml, 12-Well-Platte = 0,5 mL) und inkubieren Sie diese Platten mindestens 1 Stunde lang bei 37 °C.
>2. Aufrechterhaltung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSC)
HINWEIS: Die maximale Konfluenz pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte mit flachem Boden beträgt ~1,2 x 106 Zellen.
- Kryokonservierte iPS-Zellen mit 10 μM Y-27632 in SCM auftauen und auf eine 6-Well-Platte aufplädieren, die mit einer verdünnten Basalmembranmatrix mit reduziertem Wachstumsfaktor beschichtet ist.
- iPS-Zellen in SCM sind in den ersten 24 Stunden nach dem Auftauen mit 10 μM Y-27632 zu erhalten. Wechseln Sie nach 24 Stunden zu frischem Medium.
- Halten Sie iPSCs in SCM, bis die Zellen eine Konfluenz von 80-90 % erreichen, bevor sie passieren.
- Berechnen Sie, wie viele iPSCs für die Differenzierung benötigt werden, indem Sie die gewünschte Dichte für die Differenzierung (15.600 Zellen/cm2) mit der Oberfläche der Vertiefung multiplizieren. Multiplizieren Sie für eine 6-Well-Platte mit flachem Boden 15.600 Zellen/cm2 mit 9,6 cm2, um insgesamt 149.760 Zellen/Well zu erhalten.
- Waschen Sie die Zellen zum Durchgang mit Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS). Anschließend werden die Zellen mit nicht-enzymatischer Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (siehe Materialliste) für 5 Minuten bei 37 °C inkubiert.
- Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen vorsichtig abzuheben. Sammeln Sie Zellen in frischem SCM.
- Plattenzellen auf Zellkulturplatten auffüllen, die mit verdünntem SCM beschichtet sind, und Zellen wie in Schritt 2.3 beschrieben aufbewahren oder bei ~1,2 x 106 Zellen/ml in 1 ml SCM, 10 μM Y-27632 und 10 % DMSO (v/v) in kryokonservierten Fläschchen in flüssigem Stickstoff bei einer Temperatur von -160 °C lagern.
>3. Unterscheidung von iPSCs zu BMECs
HINWEIS: Nicht-enzymatisches EDTA trennt Zellen in Klumpen. Enzymatisches EDTA (siehe Materialtabelle) trennt Zellen in Einzelzellsuspensionen. Retinsäure (RA) sollte vor Licht geschützt werden.
- Waschen Sie iPSCs einmal mit Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS). Inkubieren Sie mit enzymatischem EDTA (1 mL für eine 6-Well-Platte, 0,5 mL für eine 12-Well-Platte und 0,25 mL für eine 24-Well-Platte) für ca. 5 Minuten bei 37 °C, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
- Zellen sammeln und bei 300 x g (relative Zentrifugalkraft) 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Resuspendieren Sie Zellpellets in SCM, die 10 μM Y-27632 enthalten.
- Bestimmen Sie die Zelldichte mit Trypan Blue und einem automatisierten Zellzähler oder einem Hämozytometer. Plattenzellen mit einer Dichte von 15.600 Zellen/cm2 oder 149.760 Zellen/Well einer 6-Well-Platte mit flachem Boden (mit einer Oberfläche von 9,6 cm2/Well) in SCM, die 10 μM Y-27632 enthält, für 24 Stunden.
- Initiieren Sie die Differenzierung nach 24 Stunden, indem Sie SCM auf E6-Medium ändern. Wechseln Sie E6 medium täglich für die nächsten 4 Tage.
- Am Tag 4 der Differenzierung wird das E6-Medium durch humanes endotheliales serumfreies Medium (hESFM) ersetzt, das mit einem verdünnten (1:200) B27-Supplement, 20 ng/ml basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und 10 μM RA ergänzt wird. Wechseln Sie dieses Medium in den nächsten 48 Stunden nicht.
- Bereiten Sie 200 mL hESFM mit verdünntem (1:200) B27 vor, mischen Sie 1 ml 50x konzentriertes B27-Supplement mit 199 mL hESFM.
- Bereiten Sie 20 ng/ml bFGF her, indem Sie 50 μg bFGF in 250 μl Tris-Puffer (5 mM Tris, pH 7,6, 150 mMNatriumchlorid, NaCl) rekonstituieren, um eine 200 μg/ml-Stammlösung herzustellen. Bereiten Sie 200 ml hESFM mit 20 ng/ml bFGF vor, indem 20 μl 200 μg/ml bFGF mit 200 mL hESFM gemischt werden.
- Bereiten Sie 10 μM RA vor, indem Sie zuerst eine 40 mg/ml RA-Stammlösung herstellen, indem Sie 2,5 mL DMSO zu 100 mg RA-Pulver hinzufügen. Verdünnen Sie diese Konzentration auf 3 mg/ml, um eine 10 mM Stammlösung herzustellen. Bereiten Sie 200 ml hESFM mit 10 μM RA vor, indem Sie 200 μl 10 μM RA in 200 mL hESFM mischen.
>4. Beschichtung von Kollagen IV (COL4) und Fibronektin (FN) Matrix zur Reinigung von iPSC-abgeleitetem BMEC
- Fügen Sie 2 ml steriles Wasser zu 2 mg FN hinzu, um 1 mg/ml FN-Stammlösung herzustellen. Fügen Sie 5 ml steriles Wasser zu 5 mg COL4 hinzu, um eine 1 mg/ml COL4-Stammlösung herzustellen.
- FN mindestens 30 Minuten bei 37 °C auflösen lassen und COL4 bei Raumtemperatur auflösen.
- FN-Stammlösung in sterilem Wasser auf eine Endkonzentration von 100 μg/ml und COL4-Stammlösung auf eine Endkonzentration von 400 μg/ml verdünnen.
- Beschichten Sie die gewünschten Platten (6-Well-Platte = 1 ml COL4/FN-Lösung, 12-Well-Platte = 0,5 mL, 24-Well-Platte = 0,25 mL und 12-Well-gefilterte Platte = 0,25 mL) mit der Mischung aus 400 μg/mL COL4 und 100 μg/mL FN.
- Die Platten mindestens 2 Stunden oder über Nacht bei 37 °C inkubieren; für Transwell-gefilterte Platten wird ein Minimum von 4 Stunden empfohlen.
>5. Subkultur und Reinigung von iPSC-abgeleiteten BMECs
HINWEIS: Die Inkubation mit enzymatischem EDTA kann länger als 15 Minuten dauern, abhängig von der Konfluenz der Zellen am Tag 6 der Differenzierung.
- Waschen Sie die Zellen am 6. Tag der Differenzierung zweimal mit DPBS. Mit 1 ml enzymatischem EDTA mindestens 15 Minuten bei 37 °C inkubieren, bis eine Einzelzellsuspension erhalten wird.
- Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur gesammelt. Resuspendieren Sie Zellpellets mit frischem hESFM mit verdünntem (1:200) B27-Supplement, 20 ng/mL bFGF und 10 μM RA.
- Keimzellen auf Platten, die mit einer Mischung aus 400 μg/ml COL4 und 100 μg/ml FN beschichtet sind. Keimzellen mit einem Verhältnis von 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte zu 3 Vertiefungen einer 12-Well-Platte, 3 Vertiefungen einer 12-Well-gefilterten Platte oder 6 Vertiefungen einer 24-Well-Platte.