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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Material einrichten
- Inkubieren Sie Kükeneier in einem handelsüblichen Tisch-Eierbrutkasten bei 37 °C. Inkubieren Sie Eier für E7-Embryonen 7 Tage lang.
- Bereiten Sie Multi-Elektroden-Arrays (MEAs) vor. Sterilisieren Sie die erforderliche Anzahl von MEAs, indem Sie sie 3 bis 4 Stunden lang in 70 % Ethanol einweichen und dann dreimal in ca. 10 ml sterilem destilliertem Wasser in der Haube der Biosicherheitsstufe II (BSLII) spülen.
Anmerkung: Die MEAs enthalten 64 nanoporöse Platinelektroden, die in einem 8 x 8 Raster angeordnet sind. Der Elektrodendurchmesser beträgt 30 μm, der Abstand zwischen den Elektroden 200 μm. Verwenden Sie kein denaturiertes Ethanol zur Sterilisation der MEAs, da dies zu Korrosion führt.
- Legen Sie die MEAs in einen sterilen Behälter mit Deckel (um sterile Bedingungen zu erhalten) und stellen Sie sie in einen Tischinkubator. Mindestens 6 Stunden bei 55 °C backen. Dieser Schritt ist entscheidend für eine ordnungsgemäße Sterilisation, und die Temperatur sollte 60 °C nicht überschreiten. Um die Sterilität zu erhalten, stellen Sie die Schale mit MEAs zur Aufbewahrung bis zur weiteren Verwendung in die BSLII-Haube.
Anmerkung: Wir verwenden eine ofenfeste Glasauflaufform mit Kunststoffdeckel und sterilisieren sie mit 70% Ethanol und legen sie zum Trocknen in die BSLII-Haube.
- Aliquotieren Sie die Lösung der extrazellulären Matrix (ECM). Tauen Sie das Fläschchen über Nacht bei 4 °C auf und frieren Sie 100 μl Aliquots bei -20 °C ein.
Anmerkung: ECM wird tiefgekühlt ausgeliefert. Es sollte nicht auf Raumtemperatur gebracht werden, bis es beschichtet werden kann, da es bei Raumtemperatur polymerisiert und nach der Polymerisation nicht mehr beschichtet werden kann. ECM ohne Wachstumsfaktoren wird bevorzugt, um zusätzliche Effekte durch unbekannte Faktoren zu verhindern.
- Sterilisieren Sie alle Präparierinstrumente (Dumont #5 Pinzette, gebogene Pinzette, kleine Schere und Federschere) und selbstklebende mit Material beschichtete Präparierschalen mit 70% Ethanol und lassen Sie sie in der Präparierhaube trocknen.
>2. Kultur und Netzwerkaktivität von Kükenembryonen
- Nehmen Sie am Tag des Plattierens ein Fläschchen ECM aus dem -20 °C Gefrierschrank, besprühen Sie es mit 70 % Ethanol und stellen Sie es auf Eis. Auf 25 % verdünnen, indem 300 μl kaltes neurobasales Medium in die BSLII-Haube gegeben werden.
- Mit einem P200-Pipettierer 100 μl 25 % ECM in die Mitte des MEA geben, dabei darauf achten, die Elektroden nicht zu berühren, und sofort einen dünnen Film auf der Oberfläche entfernen. Decken Sie das MEA ab und legen Sie es in den CO2 -Inkubator (37° C und 5% CO2), bis es bereit ist, die Neuronen zu plattieren.
- Die äußere Hülle eines E7-Eies (embryonaler Tag 7, 7 Tage lang bei 37 °C inkubiert) wird mit 70 % Ethanol sterilisiert. Enthaupten Sie den Embryo in eine Sylgard-Bodendissektionsschale, die kalte, sterile Hank's Balanced Salts Solution (HBSS) ohne Kalzium enthält. Schneiden Sie um die Augen herum und entfernen Sie die Augäpfel. Mit der feinen Pinzette DuMont #5 und der Federschere einen Schnitt auf der Bauchseite vornehmen und die äußeren Hautschichten entfernen, um das Vorderhirn und das Tectum opticum freizulegen. Die Pialmembran vorsichtig schälen und entfernen. Das Vorderhirn in eine andere Petrischale geben und mit einer Federschere in kleine Stücke von ca. 2 mm schneiden.
Anmerkung: Nach der Entfernung der Pialmembran sollten keine Blutgefäße am Vorderhirn befestigt sein. Falls verfügbar, ist es vorzuziehen, die Dissektion in einer sterilen Dissektionshaube durchzuführen, obwohl wir ziemlich gute Ergebnisse erzielt haben, wenn die Dissektion außerhalb einer Haube durchgeführt wird, solange die Instrumente und der Präparierbereich gründlich mit 70%igem Ethanol sterilisiert werden.
- Sammeln Sie mit einer sterilen Transferpipette die Stücke des Vorderhirns in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und entfernen Sie so viel HBSS wie möglich, nachdem Sie sie auf den Boden des Zentrifugenröhrchens sinken lassen.
- 1 ml 0,05 % Trypsin/Ethylendiamin-Tetraessigsäure (Trypsin/EDTA) (auf 37 °C vorgewärmt) zugeben und 15 Minuten lang bei 37 °C inkubieren.
- Entfernen Sie mit einer Pasteur-Pipette vorsichtig das Trypsin, ohne die Gewebestücke zu stören, und fügen Sie 1 ml neurobasales Medium hinzu. Lassen Sie die Gewebestücke auf den Boden sinken und entfernen Sie das Medium. Wiederholen Sie diese Wäsche noch einmal. In diesem Schritt wird das Trypsin/EDTA abgewaschen.
- Fügen Sie 2 ml neurobasales Medium hinzu und beginnen Sie mit der Trituration. Bei der Verreibung wird eine sterile, feuerpolierte Pasteur-Pipette entnommen und das Gewebe mehrmals vorsichtig durchlaufen, bis keine Stücke mehr zu sehen sind. Wenn nach wiederholten Durchgängen noch Stücke übrig bleiben, lassen Sie sie einfach auf dem Boden liegen.
Anmerkung: Vermeiden Sie das Aufschäumen beim Verreiben - wenn sich Schaum bildet, stoppen Sie ihn und entfernen Sie ihn durch Aspiration.
- Verdünnen Sie die resuspendierten Zellen 1:10 mit neurobasalem Medium und zählen Sie lebensfähige Zellen mit dem Farbstoff Trypanblau und einem Hämozytometer. Mischen Sie 50 μl der verdünnten Zellen mit 50 μl Trypanblau-Lösung in einem 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 10 μl in das Hämazytometer, nachdem Sie es auf das Deckglas gelegt haben, und zählen Sie die hellen, klaren Zellen (blaue Blutkörperchen sind tot und sollten nicht gezählt werden).
Anmerkung: Typische Zellzahlen aus einem einzigen E7-Optikum liegen zwischen 1 und 5 x 107 Zellen/ml.
- Plattieren Sie die dissoziierten Zellen auf EZM-beschichteten MEAs mit einer Dichte von 2.200 Zellen/Quadratmillimeter. Für unser MEA-System bedeutet dies etwa 130.000 Zellen pro MEA. Fügen Sie das neurobasale Medium hinzu, um das Volumen in der MEA auf 1 ml zu bringen, und platzieren Sie die MEAs über Nacht in den CO2 -Inkubator zur Zelladhäsion und Neuritenverlängerung (Abbildung 1).
Anmerkung: Für MEAs unterschiedlicher Flächen und Elektrodenzahlen konnten unterschiedliche Zelldichten ausprobiert werden - generell führt eine höhere Zelldichte zu einer größeren Netzwerkaktivität, aber auch zu kürzeren Kulturen.
