Erzeugung eines Blut-Hirn-Schranken-Chips unter Verwendung von iPSC-abgeleiteten Vorläuferzellen

Zusammenfassung

Quelle: Jagadeesan, S., et al., Erzeugung eines humanen iPSC-basierten Blut-Hirn-Schranken-Chips. J. Vis. (2020).

Dieses Video zeigt die Herstellung eines Blut-Hirn-Schranken-Chips unter Verwendung von iPSC-abgeleiteten Vorläuferzellen. Dabei werden neurale Vorläuferzellen und mikrovaskuläre Endothelzellen des Gehirns in getrennten Kanälen mit einer porösen Membran ausgesät. Durch das Fließen von Differenzierungsmedien bilden die Endothelzellen Tight Junctions, die Blutgefäßen ähneln, und die Nervenzellen reifen zu verschiedenen Gehirnzelltypen heran, wodurch eine funktionierende Blut-Hirn-Schranke auf dem Chip aufgebaut wird.

Protokoll

>1. Erzeugung von iPSC-abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen (iNPCs)

1. Herstellung von EZ-Kugeln aus iPS-Kolonien, wie unten beschrieben und wie zuvor veröffentlicht.
   1. Kultivieren Sie iPSC-Kolonien auf Basalmembranmatrix-beschichteten 6-Well-Platten (0,5 mg/Platte) in mTESR1 oder anderen kommerziellen Medien (siehe Materialtabelle).
   2. Entfernen Sie das iPS-Medium und ersetzen Sie es durch 2 mL EZ-Sphärenmedium [ESM; DMEM:F12 7:3, ergänzt mit 100 ng/ml basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), 100 ng/ml epidermalem Wachstumsfaktor, 5 μg/ml Heparin und 2% B27-Ergänzung].
   3. Kratzen Sie den Boden jeder konfluenten Vertiefung mit der Rückseite einer sterilen 1000-μl-Pipettenspitze oder eines Zellschabers ab.
   4. Sammeln Sie alle Zellen und legen Sie sie in einen T25-Kolben mit extrem geringer Anhaftung, um die spontane Bildung von frei schwebenden Kugeln zu ermöglichen. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
   5. Füttern Sie die Kugeln alle 2–3 Tage, wenn das Medium gelb wird, indem Sie die Hälfte des Mediums durch frisches ESM ersetzen. Dies ermöglicht es, dass die Kugeln in konditioniertem Medium verbleiben, was für ihr Wachstum und ihre Wartung sehr wichtig ist.
      1. Lehnen Sie den Kolben auf ein Röhrchengestell und lassen Sie die Kugeln durch die Schwerkraft 1–2 Minuten lang bis zur Ecke des Kolbens absetzen.
      2. Sobald sich der Überstand abgesetzt hat, aspirieren Sie die Hälfte des Überstands mit einer serologischen 5-ml- oder 10-ml-Pipette und ersetzen Sie ihn durch frisches, vorgewärmtes ESM.
   6. Durchgang von EZ-Kugeln wöchentlich durch Zerkleinern von Kugeln bis zu 200 μm Durchmesser, wie zuvor beschrieben. EZ-Kugeln können für bis zu 25 Durchgänge gewartet werden und sind ideal für den Einsatz zwischen den Durchgängen 8–25.
2. Bereiten Sie die einzellige Suspension von iNPCs vor:
   1. Um die neuronale Differenzierung zu induzieren, dissoziieren Sie die EZ-Kugel in einzelne Zellen.
   2. Sammeln Sie die Kugeln 3–4 Tage nach dem Zerkleinern aus einem T75-Kolben und geben Sie sie in einen konischen 15-ml-Kolben, dann lassen Sie ihn 2 Minuten stehen oder bis sich alle Kugeln am Boden abgesetzt haben.
   3. Entfernen Sie ESM langsam mit einer 5-ml-Pipette, ohne die abgesetzten Kugeln zu stören. 1 ml Dissoziationslösung (siehe Materialtabelle) zugeben und 10 min bei 37 °C inkubieren.
   4. Schwenken Sie die Dissoziationslösung und die Kugeln nach 5 Minuten Inkubation, um sicherzustellen, dass alle abgesetzten Kugeln behandelt werden.
   5. Entfernen Sie langsam die Dissoziationslösung. Fügen Sie 1 ml neuronales Differenzierungsmedium [NDM; DMEM: F12 mit 2 % B27 minus Vitamin A, 1 % N2-Supplement und vom menschlichen Gehirn abgeleiteter neurotropher Faktor (hBDNF, 20 ng/ml)].
   6. Zerreiben Sie die Kugeln in einzelne Zellen, indem Sie mit einer 1-ml-Pipette und einer 200-μl-Pipette pipettieren, bis sich alle Kugeln dissoziiert haben. Vermeiden Sie die Blasenbildung während des Verreibvorgangs.
   7. Zählen Sie dissoziierte Zellen mit einem Hämozytometer und verdünnen Sie die Zellen auf eine Enddichte von 1 x 10⁶ Zellen/ml. Es ist möglich, die Dichte je nach Anwendung zu ändern.
      Anmerkung: Höhere Dichten (bis zu 6 x 10⁶ Zellen/ml) werden für Kurzzeitkulturen von bis zu 3 Tagen empfohlen, niedrigere Dichten werden für Langzeitanwendungen von bis zu 3 Wochen empfohlen.
      Anmerkung: Die Zellen sind nun bereit, sich in den oberen Kanal des Chips auszusäen, um die "Gehirnseite" zu bilden.

2. Unterscheidung von iPSCs in iBMECs

1. Passage von iPSCs aus einem einzelnen konfluenten Well einer 6-Well-Platte im Verhältnis 1:6 in eine 6-Well-Basalmembranmatrix-beschichtete Platte. Lassen Sie die Zellen 24 Stunden lang haften. Wechseln Sie das iPSC-Medium täglich.
2. Zählen Sie die Zellen täglich mit einem Hämozytometer.
3. Wenn die Zellen eine Dichte von 1,5–3,0 x 105 Zellen/Vertiefung erreichen, ersetzen Sie das iPSC-Medium durch 3 ml unkonditioniertes Medium ohne bFGF [DMEM:F12 1:1, mit 10 % Knockout-Serumersatz (KOSR), 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 0,5 % Glutamin-Ergänzungsmittel (Materialtabelle) und 100 μM β-Mercaptoethanol]. Ersetzen Sie das Medium täglich für 6 Tage.
4. An Tag 6 ist das Medium durch Endothelzellmedium (EC) zu ersetzen [humanes endotheliales Serummedium (hESFM), ergänzt mit 1 % plättchenarmem Rinderserum aus Plasma, 20 ng/ml bFGF und 10 μM all-trans-Retinsäure (RA)]. Lassen Sie die Temperatur 2 Tage lang bei mittlerer Hitze.
5. Entfernen Sie das EC-Medium und fügen Sie 1 ml Dissoziationslösung pro Vertiefung hinzu. Inkubieren bei 37 °C für 35 min.
   Anmerkung: Während dies in der hier verwendeten Dissoziationslösung als lange Inkubationszeit angesehen wird, können iBMECs diese Behandlung mit einer Zellviabilität von mehr als 90 % überstehen.
6. Nehmen Sie die Zellen aus der Vertiefung, indem Sie die Zellsuspension vorsichtig pipettieren und alle Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen sammeln.
   Anmerkung: Vermeiden Sie hartes Pipettieren. Wenn sich die Zellen nicht leicht ablösen, inkubieren Sie weitere 5 Minuten.
7. Geben Sie 1 Volumen EC-Medium in das konische 15-ml-Medium, um Accutase zu inaktivieren, zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 200 x g, entfernen Sie das Medium und ersetzen Sie es durch 1 mL EC-Medium (ohne bFGF und RA).
8. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und stellen Sie die Zelldichte auf 14–20 x 10⁶ Zellen/ml.
   Anmerkung: Die Zellen sind nun bereit, in den unteren Kanal des Chips ausgesät zu werden, um die "Blutseite" zu bilden.

>3. Mikrofabrikation des Organchips

1. Verwenden Sie einen Organchip für das BBB-Chip-Modell und dessen Herstellung wie bisher. Der Organchip mit hohem Kanal (siehe Materialtabelle) besteht aus einem hochflexiblen Polydimethylsiloxan (PDMS)-Elastomer, das zwei übereinander liegende und parallele Kanäle im Mikromaßstab enthält, die durch eine flexible poröse Membran getrennt sind. Die Größen des oberen und unteren Mikrokanals betragen 1 mm x 1 mm bzw. 1,0 mm x 0,2 mm. Die beiden Kanäle sind durch eine 50 μm dicke, aus PDMS hergestellte flexible poröse Membran getrennt, die Poren mit einem Durchmesser von 7 μm und einem Abstand von 40 μm enthält. Die Oberfläche der porösen Membran, die die Kanäle trennt, beträgt 0,171 cm².

>4. Spänevorbereitung

1. Organchips werden vorverpackt im Chipträger geliefert, so dass die Chipausrichtung während der Handhabung nicht gestört oder verzerrt werden muss. Darüber hinaus verbindet sich der Chipträger sicher mit einem tragbaren Modul ("Pod"), das als Schnittstelle zwischen dem Kulturmodul und dem Chip fungiert.
   1. Besprühen Sie die Verpackung der Chips mit 70% Ethanol und bringen Sie sie in die Biosicherheitswerkbank (BSC).
   2. Öffnen Sie die Verpackung und legen Sie den Organchip in eine sterile Petrischale. Fassen Sie den Chipträger nur an den Seiten an, um einen direkten Kontakt mit dem Chip zu vermeiden.
   3. Stellen Sie sicher, dass die Lasche des Trägers nach rechts zeigt (Abbildung 1), und richten Sie bei Verwendung mehrerer Chips alle Chips in derselben Ausrichtung aus.
   4. Beschriften Sie jeden Chip auf der Trägerlasche (die vollständige Chipvorbereitung und der Arbeitsablauf sind in Abbildung 2 dargestellt).

>5. Oberflächenaktivierung und ECM-Beschichtung

1. Herstellung der Lösung zur Oberflächenaktivierung
   1. Das Emulat-Reagenz 1 (ER-1), das in einer Durchstechflasche mit 5 mg geliefert wird, ist lichtempfindlich. Bereiten Sie unmittelbar vor Gebrauch eine frische ER-1-Lösung vor. Die Integrität von ER-1 ist entscheidend für die erfolgreiche Vorbereitung der Chips.
   2. Schalten Sie das Licht in der BSC aus, wenn Sie ER-1.
      Anmerkung: ER-1 ist ein Augenreizmittel und muss im BSC mit geeigneten Handschuhen und Augenschutz gehandhabt werden.
   3. Lassen Sie die Reagenzien ER-1 und ER-2 vor der Verwendung auf Raumtemperatur (RT) äquilibrieren.
   4. Schützen Sie die Lösung vor Licht, indem Sie ein leeres steriles konisches 15-ml-Röhrchen mit Folie umwickeln.
   5. Klopfen Sie in der BSC kurz auf das Durchstechflasche ER-1, um das Pulver am Boden abzusetzen.
   6. Geben Sie 1 ml ER-2-Puffer in die Durchstechflasche und übertragen Sie den Inhalt sofort auf den Boden des 15 ml umwickelten konischen Röhrchens. Zum Mischen nicht pipettieren. Die Farbe der Lösung, die auf das konische Röhrchen übertragen wird, ist rot.
   7. Wiederholen Sie Schritt 5.1.6 3x. In der letzten Runde das Durchstechflasche ER-1 verschließen und umdrehen, um das restliche Pulver vom Deckel aufzufangen, dann die Lösung in das konische Röhrchen geben; Dadurch wird das Gesamtvolumen auf 4 mL ER-1-Lösung gebracht.
   8. Geben Sie 6 ml ER-2-Lösung zu den 4 ml ER-1-Lösung im konischen 15-ml-Röhrchen bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml. ER-1 sollte vollständig in der ER-2-Lösung gelöst sein.
2. Aktivierung der Oberfläche
   1. Unter Verwendung einer P200-Pipette und einer sterilen gefilterten 200-μl-Pipettenspitze können 200 μl ER-1-Mischung aufgenommen werden.
   2. Setzen Sie die Pipette in den unteren Einlass ein und drücken Sie 20 μl ER-1-Mischung durch den unteren Kanal, bis die Mischung aus dem Auslass des unteren Kanals zu fließen beginnt.
   3. Fügen Sie ca. 50 μl ER-1-Mischung hinzu und geben Sie es in den oberen Kanaleinlass. Schieben Sie die Mischung durch den oberen Kanal, bis sie aus dem oberen Kanalauslass zu fließen beginnt.
   4. Entfernen Sie alle überschüssigen ER-1-Mischungen durch sanftes Ansaugen von der Oberfläche des Chips. Stellen Sie sicher, dass das ER-1-Gemisch nur von der Chipoberfläche und nicht von den Kanälen entfernt wird.
   5. Stellen Sie sicher, dass die Kanäle frei von Luftblasen sind, bevor Sie die ultraviolette (UV) Aktivierung durchführen. Wenn Luftblasen festgestellt werden, entfernen Sie die Blasen, indem Sie den Kanal mit der ER-1-Mischung waschen.
   6. Legen Sie die offene Schale mit den Chips in die UV-Lichtbox (zur Verfügung gestellt von Emulate Inc.).
   7. Stellen Sie den Schalter an der Rückseite der UV-Lichtbox auf die Einstellung "Konsistent". Schalten Sie das Gerät ein und starten Sie die UV-Aktivierung. Die Späne 20 Min. unter UV-Licht stehen lassen< /> Anmerkung: Vermeiden Sie die Exposition des Personals gegenüber UV-Licht.
   8. Entfernen Sie das ER-1-Gemisch aus beiden Kanälen.
   9. Waschen Sie jeden Kanal mit 200 μl ER-2-Lösung.
   10. Entfernen Sie ER-2 aus beiden Kanälen.
   11. Waschen Sie jeden Kanal mit 200 μl steriler kalter Dulbecco-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (DPBS).
   12. Lassen Sie kaltes DPBS in den Kanälen, bis Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
3. Vorbereitung und Beschichtung der extrazellulären Matrix (ECM)
   1. Bereiten Sie die ECM-Lösung vor, indem Sie die einzelnen ECM-Komponenten mit kaltem DPBS, Wasser oder einem anderen Lösungsmittel bis zu den endgültigen Arbeitskonzentrationen kombinieren. Die ECM-Lösung sollte bei jeder Anwendung frisch zubereitet werden.
   2. Beschichten Sie sowohl den oberen als auch den unteren Kanal des Chips mit ECM, wobei die Zusammensetzung durch den zu säenden Zelltyp bestimmt wird. Das ECM-Gemisch muss bis zur Verwendung auf Eis gehalten werden.
   3. Verwenden Sie Laminin (50 μg/ml), um die "Gehirnseite" zu beschichten, und Kollagen IV und Fibronektin gemischt im Verhältnis 4:1 (320:80 μg/ml), um die "Blutseite" zu beschichten, wie in Abschnitt 5.6 beschrieben.
4. Aufbereitung von ECM-Aliquoten
   1. 1 mg/ml Laminin in kaltem DPBS auf eine Endkonzentration von 50 μg/ml verdünnen. Aliquotieren und bis zur Verwendung bei -20 °C lagern.
   2. Lösen Sie Kollagen IV in 0,1% Essigsäure bis zu einer Konzentration von 1 mg/ml auf. Inkubieren Sie die Lösung bei 2–8 °C über Nacht oder bei RT für 1-3 Stunden oder bis sie sich vollständig aufgelöst hat.
   3. Bereiten Sie eine 1-ml-Mischung aus Kollagen IV:Fibronektin vor (320 μl Kollagen IV, 80 μl Fibronektin, 600 μl steriles doppelt destilliertes H2O). Das Gemisch kann bei -20 °C gelagert werden.
5. Beschichten der Chips mit ECM
   1. Saugen Sie das kalte DPBS aus beiden Kanälen vollständig an. Setzen Sie eine P200-Pipette so ein, dass sie 100 μl Kollagen IV:Fibronektin-Lösung aufnimmt.
   2. Führen Sie die Lösung durch den Einlass des unteren Kanals ein, bis sich ein kleines Tröpfchen auf dem Auslass bildet. Lassen Sie ein kleines Tröpfchen auf dem Einlass, nachdem Sie die Pipettenspitze entfernt haben.
   3. Die Lamininlösung wird durch den Einlass des oberen Kanals eingeführt, bis sich ein kleines Tröpfchen am Auslass bildet. Lassen Sie ein kleines Tröpfchen auf dem Einlass, nachdem Sie die Pipettenspitze entfernt haben.
   4. Schauen Sie sich die Kanäle genau an, um sicherzustellen, dass keine Blasen vorhanden sind. Wenn Blasen vorhanden sind, waschen Sie den Kanal mit der entsprechenden ECM-Lösung, bis alle Blasen entfernt sind.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 5.5.1 bis 5.5.4 für jeden Chip.
   6. Geben Sie 1,5 mL DPBS in die Kappe eines konischen 15-ml-Röhrchens. Setzen Sie die DPBS-Kappe mit den Chips in die 150-mm-Kulturschale ein, um zusätzliche Feuchtigkeit zu gewährleisten, und versiegeln Sie die Schale mit Parafilm. Für ein optimales Ergebnis die Chips über Nacht bei 4 °C inkubieren.
      Anmerkung: Falls gewünscht, können die Zellen am selben Tag wie die Chipaktivierung und die ECM-Beschichtung ausgesät werden, obwohl eine Inkubation über Nacht bevorzugt wird. Die Chips können 4 Stunden nach Zugabe des ECM und Inkubieren der Chips bei 37 °C zur Aussaat bereit sein.

>6. Aussaat des "gehirnseitigen" Kanals und Differenzierung von EZ-Sphären in gemischte neuronale Kulturen

1. Bringen Sie das Gericht mit den vorbereiteten Chips zum BSC. Waschen Sie beide Kanäle vorsichtig mit 200 μl NDM.
2. Vermeiden Sie den Kontakt mit den Anschlüssen und saugen Sie überschüssige Medientröpfchen vorsichtig von der Oberfläche des Chips ab. Bewegen Sie die Zellsuspension vorsichtig, bevor Sie jeden Chip besäen, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten
3. Säen der iNPCs in den oberen Kanal, um die "Gehirnseite" zu erzeugen
   1. Säen Sie die Zellen (1 x 106 Zellen/ml) in den oberen Kanal des Chips. Geben Sie eine P200-Spitze mit 30–100 μl Zellsuspension in den oberen Kanaleinlass und lösen Sie die Spitze vorsichtig aus der Pipette. Nehmen Sie eine leere P200-Pipette, drücken Sie den Kolben, setzen Sie ihn in den oberen Kanalauslass ein und ziehen Sie die einzellige Suspension vorsichtig durch den Chip.
   2. Decken Sie die Schale ab und geben Sie sie in das Mikroskop, um die Aussaatdichte und die homogene Verteilung der Zellen im oberen Kanal zu überprüfen. Entfernen Sie vorsichtig die Pipettenspitze aus den Chipein- und -auslassöffnungen.
   3. Die Aussaatdichte sollte als Abdeckung von 20 % angezeigt werden. Wenn die Aussaatdichte höher oder niedriger als erwartet oder ungleichmäßig ist, geben Sie die Späne wieder in den BSC zurück, waschen Sie den Kanal 2x mit 200 μl frischem Medium und wiederholen Sie Schritt 6.3.1.
   4. Nachdem Sie die korrekte Zelldichte bestätigt haben, legen Sie die Chips sofort für 2 Stunden bei 37 °C in den Inkubator, nachdem Sie jede Charge Chips ausgesät haben. Waschen Sie die Zellen, die sich nicht mit frischem NDM anheften, weg.
   5. Halten Sie die Zellen unter statischen Bedingungen bei 37 °C mit einem täglichen NDM-Ersatz für mindestens 48 Stunden, bevor Sie den Fluss starten. iBMECs können nach dem Anheften von iNPCs oder an einem darauffolgenden Tag nach der iNPC-Aussaat ausgesät werden.

>7. Säen von iBMECs in den unteren Kanal, um die "Blutseite" zu erzeugen

1. Bringen Sie das Gericht mit den vorbereiteten Chips zum BSC. Waschen Sie den unteren Kanal vorsichtig mit 200 μl EC-Medium.
2. Vermeiden Sie den Kontakt mit den Anschlüssen, saugen Sie vorsichtig Tröpfchen mit überschüssigem EC-Medium von der Oberfläche des Chips ab und achten Sie darauf, dass das Medium in beiden Kanälen verbleibt. Rühren Sie die Zellsuspension vorsichtig um, bevor Sie jeden Chip aussäen, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten.
3. Ziehen Sie mit einer P200-Pipette 30–100 μl der iBMEC-Zellsuspension (14–20 x 10⁶ Zellen/ml) auf und setzen Sie die Spitze in den unteren Kanaleinlass ein. Trennen Sie die Spitze vorsichtig von der Pipette und lassen Sie die zellhaltige Spitze in der Einlassöffnung.
4. Drücken Sie den Kolben einer P200-Pipette mit leerer Spitze, führen Sie ihn in den Auslass des unteren Kanals ein und ziehen Sie die Einzelzellensuspension vorsichtig durch den unteren Kanal, indem Sie den Pipettenkolben langsam loslassen.
5. Überschüssige Zellsuspension von der Oberfläche des Chips ansaugen. Vermeiden Sie den direkten Kontakt mit den Einlass- und Auslassöffnungen, um sicherzustellen, dass keine Zellsuspension aus den Kanälen abgesaugt wird.
6. Decken Sie den Chip ab und übertragen Sie ihn auf das Mikroskop, um die Aussaatdichte zu beobachten. Der untere Kanal sollte ohne beobachtbare Lücken zwischen den Zellen gefüllt sein, wenn er bei 4x oder 10x unter einem Mikroskop betrachtet wird (Abbildung 3).
7. Wenn die Seeding-Dichte unter 90 % Abdeckung liegt oder ungleichmäßig verteilt ist, passen Sie die Zelldichte entsprechend an und wiederholen Sie die Schritte 7.2 bis 7.6, bis die richtige Dichte innerhalb des Kanals erreicht ist. Nach Bestätigung der korrekten Zelldichte (Abbildung 3) säen sich die Zellen in den verbleibenden Chips aus. Um Zellen an der porösen Membran zu befestigen, die sich oben im unteren Kanal befindet, drehen Sie jeden Chip um und legen Sie ihn in eine Chip-Halterung.
8. Platzieren Sie ein kleines Reservoir (konischer 15-ml-Röhrchendeckel mit sterilem DPBS) in die 150-mm-Schale, um die Zellen mit Feuchtigkeit zu versorgen. Die Chips werden bei 37 °C ca. 3 Stunden lang inkubiert, bis sich die Zellen im unteren Kanal angelagert haben. Sobald sich die iBMECs angeheftet haben (~3 h nach dem Seeding), drehen Sie die Chips wieder in eine aufrechte Position, um die Zellanhaftung am unteren Teil des unteren Kanals zu ermöglichen.

>8. Initiierung des Flusses

1. Der Flow wird in der Regel 48 Stunden nach dem Seeding der iBMECs eingeleitet. Diese Zeit wird benötigt, damit die iBMECs fest auf dem Chip haften.
2. Um die laminare Strömung durch den Chip aufrechtzuerhalten, ist es wichtig, das Medium zu entgasen und auszugleichen. Das Medium muss 1 h lang in einem 37 °C warmen Wasserbad vorgewärmt werden.
3. Bis zu 50 mL erwärmtes Medium können durch Inkubation unter einem vakuumbetriebenen Filtrationssystem für 15 min entgast werden.
4. Grundierung von portablen Modulen
   1. Desinfizieren Sie die Außenseite der Verpackung und der Schalen des tragbaren Moduls mit 70 % Ethanol, wischen Sie sie ab und übergeben Sie sie an den BSC. Öffnen Sie die Verpackung und legen Sie die Module in das Fach ein. Richten Sie sie mit den Behältern nach hinten in das Tablett aus.
   2. Pipettieren Sie 3 ml voräquilibriertes, warmes Medium in jedes Einlassreservoir. Geben Sie EC-Kulturmedium in das Einlassreservoir des unteren Kanals und NDM in das Einlassreservoir des oberen Kanals des oberen Kanals (Abbildung 4).
   3. Pipettieren Sie 300 μl voräquilibriertes, warmes Medium direkt über jeden Auslassanschluss in jedes Auslassreservoir (Abbildung 4).
   4. Platzieren Sie bis zu sechs tragbare Module auf jedem Fach. Bringen Sie die Tabletts in den Inkubator und schieben Sie sie mit dem Tablettgriff nach außen vollständig in das Kulturmodul.
   5. Wählen Sie den "Prime"-Zyklus auf dem Kulturmodul aus, und führen Sie ihn aus. Schließen Sie die Inkubatortür und lassen Sie das Kulturmodul die tragbaren Module ansaugen (dauert ~1 min). Der Grundierungszyklus ist abgeschlossen, wenn in der Statusleiste "Bereit" angezeigt wird. Nehmen Sie das Tablett aus dem Kulturmodul und bringen Sie es zum BSC.
   6. Stellen Sie sicher, dass die tragbaren Module erfolgreich vorbereitet wurden, indem Sie die Unterseite jedes tragbaren Moduls im BSC überprüfen. Achten Sie auf das Vorhandensein kleiner Tröpfchen an allen vier Anschlüssen.
      1. Wenn ein tragbares Modul keine Tröpfchen anzeigt, führen Sie den Prime-Zyklus auf diesen Modulen erneut aus. Wenn Medien auf das Fach getropft sind (dies kann häufiger durch die Auslassöffnungen vorkommen), reinigen Sie das Fach mit 70 % Ethanol.
5. Anschluss von Chips an tragbare Module, Regelung und Einleitung des Flusses
   1. Waschen Sie beide Kanäle jedes Chips vorsichtig mit warmem, äquilibriertem zellspezifischem Kulturmedium, um mögliche Blasen im Kanal zu entfernen, und platzieren Sie kleine Medientröpfchen (entsprechend dem Medium im Kanal) auf der Oberseite jedes Einlass- und Auslassanschlusses.
   2. Setzen Sie Chips mit Trägern in die tragbaren Module ein und platzieren Sie bis zu sechs auf jedem Fach. Setzen Sie die Tabletts in das Kulturmodul ein. Programmieren Sie die entsprechenden Kulturbedingungen für Organchips (Flussrate und Dehnung) auf dem Kulturmodul.
   3. Die programmierten Bedingungen werden gestartet, sobald der Zyklus "Regeln" abgeschlossen ist.
      Anmerkung: Die Durchflussraten für jeden Kanal können unabhängig voneinander gesteuert und auf Raten von 0 bis 1.000 μl/h eingestellt werden. Der BHS-Chip wird typischerweise bei 30 μL/h kultiviert. Bei strömenden Medien wie EC-Medien oder ESM mit 30 μL/h und 1000 μL/h betragen die Scherkräfte 0,01 dyn/cm² bzw. 0,33 dyn/cm².
   4. Führen Sie den "Regulate"-Zyklus durch, der ca. 2 Stunden dauert, wonach das Kulturmodul unter den voreingestellten Kulturbedingungen der Organchips zu fließen beginnt.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Draufsicht auf den Chip im Chipträger mit beschrifteten Anschlüssen.

Abbildung 2: Flussdiagramm der iPSC-basierten BBB-Chipvorbereitung und des Arbeitsablaufs. Vor Beginn des Arbeitsablaufs ist eine...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Accutase	EMD Millipore	Artikel-Nr. SCR005	Dissoziationslösung
Nr. B27	Gibco	12587010
Bfgf	Peprotech	100-18 Mrd.
Chip-S1	Emulate Inc	Chip-S1	Organ-Chip
Kollagen IV	Sigma	Nr. C5533
DMEM: F12	Thermo Fisher Scientific	31330038
Reagenz 1 emulieren (ER-1)	Emulate Inc	ER-1
Reagenz 2 emulieren (ER-2)	Emulate Inc	ER-2
Fibronektin	Sigma	Nr. F1141
Glutamax	Lebenstechnologien	35050038	Glutamin-Ergänzung
hBDNF	Peprotech	Nr. 450-02
KOSR	Thermo Fisher Scientific	10828028
Laminin	Sigma	Nr. L2020
Matrigel	Corning	354234	Basalmembran-Matrix
mTeSR1	StemCell Technologies, Inc.	Artikel-Nr.: 85851
NEAA	Biologische Industrien	01-340-1B
NutriStem	Biologische Industrien	05-100-1A	Alternative Medien
Rinderserum (PPP) mit plättchenarmem Plasma	Biomedizinische Technologien	J64483AB
Retinsäure (RA)	Sigma	Nr. R2625
Steriflip-GP Sterile Zentrifugen-Filtereinheit mit Röhrchen	Millipore	SCGP00525
β-Mercaptoethanol	Lebenstechnologien	31350010