Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung von Gehirnschnitten
- Verwenden Sie männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 4-8 Wochen. Halten Sie die Tiere in einem klimatisierten Raum (21-23 °C; 50 % Luftfeuchtigkeit; 12 Stunden/12 Stunden Hell-/Dunkelzyklus, Licht an um 8:00 Uhr) mit freiem Zugang zu Futter und Wasser.
- Nehmen Sie ein Aliquot von 250 ml des künstlichen Liquors (aCSF) und geben Sie es in ein Becherglas, das Eis enthält. Gleichzeitig liefern Sie kontinuierlich Gas, das zu 95 % ausO2 und zu 5 % aus CO2 besteht.
- Chirurgie
- Betäuben Sie das Tier mit 4% Isofluran in einem Glaskasten für ca. 3 min. Sobald das Tier eine chirurgische Narkosetiefe erreicht hat (angezeigt durch das Fehlen einer Reaktion auf das Einklemmen der Zehen), legen Sie es auf ein flaches Tablett, das mit zerstoßenem Eis gefüllt ist, und entfernen Sie den Kopf mit einer Schere.
- Legen Sie den Schädel frei und schneiden Sie den verbleibenden Muskel ab. Als nächstes schälen Sie mit Rongeuren die dorsale Oberfläche des Schädels vom Gehirn ab. Schneide die Seiten des Schädels mit Rongeuren ab. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente mit einer 75%igen Ethanollösung.
- Schneiden Sie mit einem Spatel die Riechkolben und Nervenverbindungen entlang der ventralen Oberfläche des Gehirns und entfernen Sie das Gehirn. Nach der Enthauptung wird das Gehirn schnell in ein Becherglas gegeben, das mit eiskaltem, sauerstoffreichem aCSF gefüllt ist.
- Präparation des medialen Thalamus (MT)-vorderen cingulären Kortex (ACC) Hirnschnitts
Anmerkung: Bereiten Sie Slices vor, die den Weg von der MT zum ACC enthalten.
- Schneiden Sie den Hirnblock von Hand mit zwei sagittalen Schnitten 2,0 mm lateral der Mittellinie in jeder Hemisphäre, um die subkortikale Anatomie darzustellen. Machen Sie dann zwei abgewinkelte Schnitte. Machen Sie den ersten Querschnitt parallel zum sichtbaren Fasertrakt im Striatum.
- Machen Sie den zweiten Schnitt von der Verbindung zwischen dem Kleinhirn und der Sehrinde bis zum Mittelpunkt zwischen der vorderen Kommissur und dem Tractus opticus, die ventral und parallel zur Thalamocingulatbahn verlaufen.
- Befestigen Sie den Hirnblock mit Cyanacrylatkleber an einer eckigen Platte (~120°) und machen Sie einen Schnitt knapp über dem Wendepunkt der Bahn. Falten Sie die Platte auf, drücken Sie sie flach und kleben Sie sie auf die Kammerstufe eines Vibratoms.
- Mache mediale Thalamus-ACC-Hirnschnitte (500 μm dick) und tauche sie dann in eiskaltes, sauerstoffhaltiges aCSF. Die Scheiben werden in die Aufnahmekammer überführt und 1 Stunde lang bei 32 °C unter kontinuierlicher Perfusion (12 ml/min) mit sauerstoffreichem aCSF aufbewahrt.
