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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE Veterinärprüfungsausschuss überprüft.
>1. Dorsolaterale Telencephalon-Mikrodissektion
- Bereiten Sie das Dissektionsmedium (100 ml) vor: 98,5 mL Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), 0,5 mL 5 M 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES) pH 7,4, 1 mL Penicillin/Streptomycin (10.000 Einheiten/ml und 10.000 μg/ml).
- Sterilisieren Sie das Dissektionsmedium mit einem Filter.
- Entnahme von embryonalen Embryonen am Tag 14 (E14) einer trächtigen Maus C57/Bl6 (Mus musculus) unter Narkose mit Isofluran.
Anmerkung: Betrachten Sie E0 als den Tag der Erkennung des Vaginalplugs. Die Dissektion sollte spätestens 1 Stunde nach der Entnahme aus der trächtigen Maus abgeschlossen sein. Dieses Protokoll gilt auch für die Embryonen E11-E17.
- Entnahme der Embryonen durch Hysterektomie unter sterilen Bedingungen.
- Übertragen Sie die Embryonen in eine Petrischale mit einem kalten Präpariermedium (4 °C).
- Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel, indem Sie entlang der Längsfissur schneiden. Die Anzahl der Embryonen variiert in der Regel zwischen fünf und zehn. Jedes E14-Gehirn liefert etwa 2 x 106 Zellen, einschließlich Vorläuferzellen und postmitotischer Neuronen (Verhältnis 1:1)
Anmerkung: Verwenden Sie das Stereomikroskop für die folgenden Schritte.
- Entfernen Sie die Hirnhäute mit einer Präparierzange. Teile das Telencephalon in der Mitte, um die Hemisphären zu trennen. Um das dorsolaterale Telencephalon zu isolieren, schneiden Sie mit einer Dissektionszange entlang der dorsomedialen Kurve und der pallial-subpallialen Grenze. Das dorsolaterale Telencephalon wird in ein 2-ml-Röhrchen mit einem kalten Präpariermedium (4 °C) überführt, bis alle Gehirne präpariert sind.
>2. Zelldissoziation und Beschichtung
- Bereiten Sie das Proliferationsmedium vor (50 ml DMEM + 10 % FCS): 44 ml Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), 5 ml fötales Kälberserum (FCS), 0,5 ml 40 % Glukose, 0,5 ml Penicillin/Streptomycin (10.000 Einheiten/ml und 10.000 μg/ml). Sterilisieren Sie das Proliferationsmedium.
- Bereiten Sie das Differenzierungsmedium (50 mL DMEM + 2 % B27) vor: 48 mL DMEM, 1 mL B27, 0,5 mL 40 % Glukose, 0,5 mL Penicillin/Streptomycin (10.000 Einheiten/ml und 10.000 μg/ml). Filtrieren Sie das Differenzierungsmedium.
- Nach der Mikrodissektion des dorsolateralen Telencephalons von E14-Mäusen wird das Röhrchen mit dem gesammelten Gewebe und dem Kaltdissektionsmedium (für 5 min bei 4 °C, 340 x g) zentrifugiert, um das Gewebe auszufällen.
- Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und fügen Sie 1 ml vorgewärmte (37 °C) Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (0,05 %) für den chemischen Aufschluss hinzu. 15 Minuten bei 37 °C inkubieren. 2 ml Proliferationsmedium hinzufügen, um die Trypsinaktivität zu stoppen.
- Polieren Sie die Spitze einer Pasteurpipette aus Glas über einem Gasbrenner oder Bunsenbrenner einige Sekunden lang, um die Öffnung etwas zu verkleinern. Waschen Sie die Pipette, indem Sie FCS absaugen, um die Spitze zu beschichten. Um Blasen zu vermeiden, dissoziieren Sie die Zellen mechanisch mit einer feuerpolierten und FCS-beschichteten Pasteur-Pipette.
- Die Zellen zentrifugieren (5 min bei 4 °C, 340 x g). Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Geben Sie 1 ml Proliferationsmedium hinzu und resuspendieren Sie die Zellen mit einer Pipette. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
- Bereiten Sie eine 1:1-Verdünnung der Zellsuspension mit einer 0,4%igen Trypanblau-Lösung vor. Die nicht lebensfähigen Zellen sind blau. Zählen Sie mit einer Neubauer-Kammer die Anzahl der lebensfähigen Zellen (ungefärbt).
- Verdünnen Sie die Zellen in einem Proliferationsmedium, um 106 Zellen/ml zu erhalten. Geben Sie 500 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte (ca. 2,5 × 105 Zellen/cm2). Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2,
Anmerkung: Verwenden Sie keine Abdeckgläser aus Glas, da diese sich während des Experiments verschieben und das Betrachtungsfeld verändern können. Alternativ können Sie auch Gewebekulturplatten mit Glasboden verwenden.
Anmerkung: Wenn Sie keine mit Zellkulturen behandelten Multischalen verwenden, ist es wichtig, Ihre Platten 2 h lang bei 37 °C mit Poly-D-Lysin (50 μg/ml) vorzubehandeln. PDL-behandelte Platten können nach dem Waschen mit destilliertem Wasser bei 4 °C gelagert werden.