Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.
>1. Sammeln Sie lumbale DRG von experimentellen Ratten
- Verwenden Sie 2 bis 3 Wochen alte Sprague-Dawley (SD) Ratten für die lumbale DRG-Entnahme.
HINWEIS: DRG-Neuronen, die von Ratten im Alter von mehr als 4 Wochen entnommen wurden, wachsen unter den hier beschriebenen Kulturbedingungen nicht gut.
- Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente in einem Autoklaven.
- Betäuben Sie die Ratte mit einer 1:1-Mischung aus Tiletamin und Zolazepam (20 mg/kg; intraperitoneale Injektion (IP)) und warten Sie, bis das Tier in einem Zehenquetschtest keine Reaktion auf den Fußrückzug zeigt.
Anmerkung: In diesem Protokoll können verschiedene Anästhesiestrategien erfolgreich eingesetzt werden.
- Opfere die Ratte durch Enthauptung mit einer handelsüblichen Guillotine.
- Verwenden Sie die Guillotine, um den Körperrumpf der Ratte zwischen Vordergliedmaße und Oberschenkelknochen zu isolieren. Abbildung 1A zeigt ein Diagramm des zu erfassenden Bereichs.
Anmerkung: Die kaudale Schnittlinie sollte gerade rostral zum Oberschenkelknochen verlaufen. Das lumbale L6 DRG wird exzidiert, wenn die Schnittstelle zu hoch in der Wirbelsäule liegt.
- Entlang des Brustbeins schneiden und alle Organe/Gewebe mit einer Präparierschere entfernen (Abbildung 2A-a).
- Schneiden Sie an der Seite des Rüssels entlang, um den dorsalen Teil der Ratte zu sammeln und die Haut zu entfernen. Siehe Abbildung 1B für ein Foto des präparierten dorsalen Rumpfes.
- Bereiten Sie das Tuch auf Eis vor, bevor Sie DRG sammeln. Reinigen Sie die Handschuhe von Fell und Blut und sterilisieren Sie sie mit 75% Ethanol, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Entferne die Muskeln, die die Lendenwirbelsäule bedecken. Machen Sie zunächst zwei Schnitte entlang der Seiten der Wirbelsäule (links und rechts) und einen seitlichen Schnitt, um die rostrale Ausdehnung der Lendenwirbelsäule zu markieren. Entfernen Sie dann die dorsalen Muskeln der Wirbelsäule mit einer Knochenschneidzange (Abbildung 2A-b).
- Entfernen Sie den dorsalen Teil der Wirbel mit einer Knochenschneidzange und legen Sie das Rückenmark frei.
- Entfernen Sie das Rückenmark mit einer Präparierschere (Abbildung 2A-c) und einer Pinzette (Abbildung 2A-d).
- Identifizieren Sie die lumbale DRG, indem Sie die Wirbel ab der letzten Rippe (Brustwirbel 13) zählen. In Abbildung 1C ist ein Diagramm der Wirbelpositionen zu sehen.
- Sammeln Sie das bilaterale lumbale DRG (L1-L6) mit einer Mikroschere (Abbildung 2A-f) in eine 35-mm-Kulturschale mit 2 mL eiskaltem, serumfreiem Medium. Entfernen Sie die neuronalen Fasern (wie in Abbildung 1C gezeigt) aus der Verbindung von DRG und übertragen Sie es dann in die Kulturschale, um die Reinheit der Kulturen zu verbessern.
Anmerkung: Das gesammelte DRG kann in Medium auf Eis für ca. 1 h aufbewahrt werden. In der Zwischenzeit können mehrere Ratten eingeschläfert werden, um einen größeren DRG-Pool zu schaffen.
2. Primärkultur von Rattenholz DRG
HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden.
- Bereiten Sie das Kulturmedium vor, das 10 % fötales Rinderserum, 100 mM Natriumpyruvat und 1 x Penicillin/Streptomycin in 1 x DMEM-F12 enthält.
- Die mit Zellkulturen behandelte 24-Well-Platte 2 h lang mit 200 μg/ml Poly-L-Lysin bestreichen und dann mit sterilisiertem Wasser waschen.
- Inkubieren Sie die Kulturschale mit 1 mL Nährmedium in einem 37 °CCO 2 -Inkubator vor der Verwendung für mindestens 30 Minuten.
- Übertragen Sie die DRG-haltige 35-mm-Schale in eine Laminarhaube und waschen Sie die DRG 3 Mal mit der Pipette mit serumfreiem Medium.
Anmerkung: Die Außenseite der Schale sollte vor dem Einfüllen in die Haube mit 75 % Ethanol gereinigt werden. Die 35-mm-Schüssel kann DRG von einer Reihe von Ratten enthalten (dies hängt von den Anforderungen des Versuchsdesigns ab).
- Bringen Sie das DRG (von einer einzelnen Ratte oder kombiniert aus mehreren Ratten) mit einer sterilen Pinzette in eine neue 35-mm-Kulturschale, die 2 ml Kollagenase Typ IA (1 mg/ml in serumfreiem Medium) enthält (Abbildung 2A-e).
Anmerkung: Die Kollagenaselösung sollte sterilisiert werden, indem sie durch einen 0,22 μm Spritzenfilter geleitet wird.
- Das DRG in der Kollagenaselösung in einem 37 °CCO 2 -Inkubator für 30 min verdauen.
- Entfernen Sie die Kollagenaselösung und waschen Sie das DRG 3 Mal in 2 mL Hank's balanced salt solution (HBSS).
Anmerkung: Es können Fasern oder Gewebereste vorhanden sein, die sich vom DRG in die Lösung lösen. Entfernen Sie sie mit einer Pipette mit der Waschlösung.
- Geben Sie 2 mL vorgewärmtes 0,05%iges Trypsin-EDTA in die DRG-haltige 35-mm-Schale und verdauen Sie das DRG in einem 37 °CCO 2 -Inkubator für 30 min.
- Die 2 mL der DRG-haltigen Lösung werden mit einer Glaspipette in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt.
Anmerkung: Das DRG kann an der Glaspipette haften bleiben, daher sollte dieser Schritt mit Vorsicht durchgeführt werden. DRG-Verluste können vermieden werden, indem die DRG-haltige Lösung im konischen Ende einer Glaspipette (ca. 0,5 mL) aufbewahrt und die Lösung langsam, aber ohne Pause in das Zentrifugenröhrchen überführt wird.
- Die Lösung wird bei 290 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie ein weiteres serumfreies 2-ml-Medium hinzu, um das DRG zu resuspendieren.
- Wiederholen Sie Schritt 2.10 2 Mal, aber wechseln Sie das serumfreie Medium beim letzten Mal auf vorgewärmtes Kulturmedium.
- Zerreiben Sie die DRG ca. 60 Mal manuell mit einer flammpolierten Pasteurpipette (Länge 230 mm und Innendurchmesser des Spitzenkopfes 1 mm). In Abbildung 2B ist ein Foto zu sehen, auf dem die Öffnung einer flammpolierten Pasteur-Pipette mit einer unpolierten Pipette verglichen wird.
Anmerkung: Der Innendurchmesser der flammpolierten Pasteur-Pipette ist ca. 10 % kleiner als der der Kontrollpipette und die Innenseite des konischen Endes sollte glatter sein. Achte darauf, dass du beim Verreiben der Zellen keine Blasen bildest.
- Nehmen Sie die mit Poly-L-Lysin beschichtete Schale aus dem CO2 -Inkubator. Aspirieren Sie das inkubierte Kulturmedium aus der Schale und säen Sie die dissoziierten Zellen auf die beschichtete Schale.
- Die DRG-Zellen einer Ratte (bilaterale Entnahme von L1-L6, für insgesamt 12 DRG) werden in vier Vertiefungen einer 24-Well-Platte ausgesät; es befinden sich ungefähr 5 x 104 Zellen in einer Vertiefung einer 24-Well-Platte.
Anmerkung: Diese Dichte ist für die Immunfärbung geeignet. Für die Western-Blot- oder RNA-Extraktion säen Sie die DRG-Zellen einer Ratte (bilaterales L1-L6) in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte.
- Ersetzen Sie das Nährmedium am nächsten Tag durch die Zugabe von 10 μM Cytarabin (Ara-C) und 100 ng/ml NGF und erneuern Sie das Medium danach alle zwei Tage.
Anmerkung: Die thorakalen DRG können auch nach diesem Protokoll kultiviert werden, wenn sie aus der Brustwirbelsäule entnommen wurden.
