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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
HINWEIS: Zellkulturlösungen sollten mit sterilen Verfahren in einer biologischen Sicherheitswerkbank hergestellt und bei 0,2 μm filtriert werden, um eine Kontamination zu verhindern.
>1. Vorbereitung von Lösungen und Nährmedium
- Bereiten Sie die Laminin-Beschichtungslösung vor, indem Sie 20 μl 1 mg/ml-Lamininbrühe in 2 ml steril destilliertes H2O verdünnen. Am Tag der Dissektion zubereiten.
- Bereiten Sie 10% Pferdeserum (ES) Stopplösung vor, indem Sie 5 ml ES zu 45 ml 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) hinzufügen. Sterilfilter mit einem 0,2 μm Filtersystem oder einer Spritzenfilterspitze. Bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie eine 4%ige Stammlösung aus Rinderserumalbumin (BSA) vor, indem Sie 2 g BSA-Pulver zu 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hinzufügen und auf ein Endvolumen von 45 ml bringen. Sterilfilter mit einem 0,2 μm Filtersystem oder einer Spritzenfilterspitze. Bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie Papain-Stammlösung vor, indem Sie Papain in 1x HBSS auf 3 mg/ml verdünnen. Sterilfilter mit einem 0,2 μm Filtersystem oder einer Spritzenfilterspitze. Bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie eine Desoxyribonuklease (DNase)-Lösung vor, indem Sie 20 mg DNase-Pulver zu sterilem H2O hinzufügen und auf ein Endvolumen von 20 ml bringen. Sterilfilter mit einem 0,2 μm Filtersystem oder einer Spritzenfilterspitze. Bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie eine Ascorbinsäure-Stammlösung her, indem Sie 352 mg Ascorbinsäure zu sterilem destilliertem H2O hinzufügen und auf ein Endvolumen von 20 ml bringen. Bei Bedarf in einem 37 °C heißen Bad erhitzen, um sich aufzulösen. Sterilfilter mit einem 0,2 μm Filtersystem oder einer Spritzenfilterspitze. Bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie das Zellkulturmedium vor, indem Sie 50 ml Neurobasalmedium Folgendes hinzufügen: 500 μl Glutamax (100x), 500 μl Pferdeserum, 1 ml B-27, 100 μl Ascorbinsäure, 500 μl Penicillin-Streptomycin, 50 μl Kanamycin und 50 μl Ampicillin. Sterilfilter mit einem 0,2 μm Filtersystem. Bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie 0,01% Triton X-100 Lösung vor, indem Sie 1 ml Triton X-100 in 9 ml 1x PBS geben, um eine 10% ige Lösung herzustellen. Da Triton X-100 viskos ist, pipettieren Sie langsam, damit sich die Spitze vollständig füllen kann. In einem 37 °C heißen Bad erhitzen, um es bei Bedarf aufzulösen. Bei 4 °C lagern.
- Um 10 % der Triton X-100-Aktien auf 0,01 % zu verwässern, führen Sie 3 serielle Verdünnungen im Verhältnis 1:10 durch. Verdünnen Sie 1 ml 10%igen Stamm in 9 ml 1x PBS, um eine 1%ige Lösung herzustellen. Verdünnen Sie 1 ml 1%ige Lösung in 9 ml 1x PBS, um eine 0,1%ige Lösung herzustellen. Verdünnen Sie 1 ml 0,1%ige Lösung in 9 ml 1x PBS, um eine 0,01%ige Lösung herzustellen.
- Bereiten Sie 10%ige und 1%ige Lösungen aus normalem Ziegenserum (NGS) vor, indem Sie 1 ml NGS zu 9 ml 1x PBS für eine 10% ige Lösung und 100 μl NGS zu 9,9 ml 1x PBS hinzufügen, um eine 1% ige Lösung herzustellen.
- Bereiten Sie eine Glutamat-Stammlösung (100 mM) vor, indem Sie 735 mg L(+)-Glutaminsäure zu steril destilliertem H2O hinzufügen und auf ein Endvolumen von 50 ml bringen. Die Löslichkeit bei dieser Konzentration wird ein Problem sein. Die Zugabe kleiner Volumina (100 μl) von 1 M Salzsäure ist ausreichend, um die Löslichkeit zu erhöhen.
- Bereiten Sie die NBQX-Stammlösung (10 mM) vor, indem Sie 50 mg NBQX zu sterilem destilliertem H2O hinzufügen und auf ein Endvolumen von 13 ml bringen.
>2. Zubereitung von Kulturschalen und Deckgläsern (Erfolgt am Tag vor der Sektion)
HINWEIS: Wir haben festgestellt, dass die Kombination von drei Beschichtungsmitteln, Poly-L-Lysin, Poly-L-Ornithin und Laminin, eine ideale Zelladhäsion und Lebensfähigkeit ermöglicht.
- Stellen Sie 10 Petrischalen 35 mm in eine biologische Sicherheitswerkbank. Legen Sie je zwei kreisrunde 12 mm Deckgläser in jede Schale und füllen Sie sie 10 min lang mit 70% EtOH. Verwenden Sie eine Vakuumleitung, um das restliche EtOH aus jeder Schale abzusaugen, damit das EtOH vollständig verdampfen kann.
- Pipettieren Sie ~90-100 μl 0,1%ige Poly-L-Lysinlösung auf jedes Deckglas und stellen Sie sicher, dass das gesamte Deckglas bedeckt ist. Decken Sie die Schalen mit Deckeln ab und stellen Sie sie für 1 h in einen 37 °C heißen Inkubator.
- Die restliche Poly-L-Lysin-Lösung aus jedem Deckglas aspirieren und mit sterilem H2O abspülen.
- Die Schritte 2.2 – 2.3 mit 0,1%iger Poly-L-Ornithin-Lösung wiederholen.
- Wiederholen Sie erneut die Schritte 2.2 – 2.3 mit 0,01%iger Lamininlösung. In einen 37 °C/5 % CO2 -Inkubator stellen, bis er am nächsten Tag für die Zellbeschichtung bereit ist.
>3. Embryonale Dissektionen von Mäusen
HINWEIS: Wir verwenden zwischen 4 und 6 zeitgesteuerte trächtige Mäuse pro Kultur. Obwohl ein Großteil des Dissektionsprozesses außerhalb einer biologischen Sicherheitswerkbank stattfindet, ist es dennoch wichtig, ein steriles Verfahren aufrechtzuerhalten. Die reichliche Verwendung von 70% EtOH auf Oberflächen in der Nähe des Präpariermikroskops und auf chirurgischen Instrumenten ist ideal. Während der Dissektion kann auch eine Maske getragen werden, um eine Kontamination weiter zu verhindern. Zusätzlich verwenden wir 4 separate Antibiotika im Nährmedium, so dass eine Kontamination unwahrscheinlich ist. Wenn der Einsatz von Antibiotika jedoch problematisch ist, kann diese Dissektionseinrichtung in eine sterile Haube verlegt werden. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten, sollten alle Dissektionslösungen bei 4 °C vorgekühlt werden, und die Dissektionen sollten so schnell wie möglich abgeschlossen werden. Wir führen die Sezierungen nicht auf Eis durch. Das Verfahren zur Dissektion von embryonalen Mittelhirnneuronen der Maus ist identisch mit den zuvor beschriebenen Methoden.
- Bereiten Sie mit einem saugfähigen Pad einen Platz auf einer Bank in der Nähe eines Präpariermikroskops vor und sprühen Sie großzügig mit 70% EtOH.
- Besprühen Sie zwei 100 x 15 mm große Petrischalen aus Glas und eine Petrischale aus 50 x 10 mm Glas mit 70 % EtOH und lassen Sie das EtOH verdampfen. Nach dem Verdampfen 50 ml steriles 1x HBSS in jede 100 x 15 mm große Petrischale geben.
- Tauchen Sie chirurgische Schere, Pinzette und Mikrotomklinge zum Sterilisieren mindestens 10 Minuten lang in 70 % EtOH. Legen Sie die Instrumente zum Trocknen auf das saugfähige Pad.
- Mit CO2 gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation euthanasieren Sie 2-3 Monate alte zeitgesteuerte Trächtigkeitsmäuse am embryonalen Tag 14.
- Besprühen Sie den Bauch der euthanasierten Mäuse mit 70% EtOH. Fassen Sie mit einer Pinzette den Unterbauch und öffnen Sie die Bauchhöhle mit einer chirurgischen Schere. Beginnen Sie mit dem Schneiden in der Nähe der Stelle, an der die Pinzette den Bauch hält, und machen Sie seitliche Schnitte auf jeder Seite, bis die Bauchdecke zurückgeklappt werden kann und die Gebärmutter deutlich sichtbar ist.
- Schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere beide Enden des Gebärmutterhorns ab. Entfernen Sie dann die Gebärmutter und legen Sie sie mit 1x HBSS in eine Petrischale.
- Mit einer Zange mit gerader Spitze werden die Embryonen vorsichtig aus der Gebärmutter entnommen. Lassen Sie die Embryonen während dieses Prozesses in HBSS. Enthaupten Sie die Embryonen entweder mit der Pinzette oder einer Mikrotomklinge, indem Sie in der Nähe des Halses schneiden. Einen möglichst ebenen Schnitt machen.
- Bewegen Sie unter einem Präpariermikroskop einen Embryokopf in eine trockene 50-mm-Petrischale und legen Sie ihn auf die Bauchseite. Stabilisieren Sie den Kopf mit einer Pinzette, indem Sie ihn in der Nähe der Augen/Schnauze platzieren und penetrieren. Die Pinzette sollte in einem Winkel von ~45° nach unten geneigt werden, um ein Eindringen in das Mesencephalon zu vermeiden.
Entfernen - Sie hingegen mit der Pinzette vorsichtig die durchscheinende Schicht von Haut und Schädel kurz vor dem markanten Kamm des Mesencephalons. Beginnen Sie in der Nähe der Mittellinie und entfernen Sie Haut und Schädel kaudal, bis das Mesencephalon vollständig freigelegt ist.
- Halten Sie die Pinzette senkrecht zum freiliegenden Mesencephalon, mit einer Spitze zwischen Kortex und Mesencephalon und der anderen in der Nähe des Kleinhirns. Drücken Sie die Pinzette nach unten und drücken Sie sie zusammen, um das gesamte Mittelhirn zu entfernen. Das Mittelhirnsegment sollte etwa 0,5 mm dick sein. Legen Sie das Mittelhirnsegment in die zweite Petrischale, die mit frischem 1x HBSS gefüllt ist. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Embryo.
- Positionieren Sie das Hirnsegment mit dem Präpariermikroskop mit der Bauchseite nach oben. Wenn die Hirnhäute noch befestigt sind, entfernen Sie sie vorsichtig, indem Sie sie mit der Pinzette greifen und nach oben und vom Gehirnsegment weg anheben.
- Das Gehirnsegment sollte 4 sichtbare Quadranten haben. Platzieren Sie das Segment so, dass die beiden kleineren Quadranten über den beiden größeren Quadranten positioniert sind. Es gibt einen markanten Grat, der die oberen zwei (kleinen) Quadranten von den beiden unteren (großen) Quadranten trennt.
- Kneifen und trennen Sie mit der Pinzette die oberen Quadranten von den unteren Quadranten und verwerfen Sie dann die oberen Quadranten. Die verbleibenden unteren Quadranten haben überschüssiges Gewebe lateral auf der dorsalen Seite, dieses Gewebe sieht weniger undurchsichtig aus als das verbleibende ventrale Gewebe. Entfernen Sie das weniger dichte Rückengewebe und entsorgen Sie es. Das verbleibende Segment sollte sowohl die Substantia nigra pars compacta (SNc) als auch das ventrale tegmentale Areal (VTA) enthalten.
- Schneiden Sie mit der Pinzette das verbleibende ventrale Gewebesegment in 4 kleinere Stücke und übertragen Sie diese Segmente mit einer 1 ml-Pipette mit breiter Bohrung in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 1x HBSS. Halten Sie den konischen Schlauch mit den Gehirnsegmenten während des gesamten Eingriffs auf Eis.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle verbleibenden Gehirnsegmente.
>4. Dissoziation von Zellen
- Enzymatischer Verdau von Zellen
- Aspirieren Sie das HBSS vorsichtig aus dem konischen 15-ml-Röhrchen, das die Mittelhirnsegmente enthält, und lassen Sie die Segmente am Boden des Röhrchens.
- Geben Sie ~800 μl Papainlösung in das Röhrchen und stellen Sie es für 7 Minuten in einen 37 °C Inkubator. Resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie das Röhrchen schnippen, und ersetzen Sie es für weitere 7 Minuten durch den 37 °C Inkubator.
- Entfernen Sie mit einer 1-ml-Pipettenspitze mit breiter Bohrung nur die Mittelhirnsegmente in ein 1-ml-Aliquot von DNase. Lassen Sie die Segmente den unteren Rand des Aliquots oder etwa 1 Minute der Belichtung erreichen.
- Mit einer 1-ml-Pipettenspitze mit breiter Bohrung werden nur die Mittelhirnsegmente in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 2 ml Stopplösung entfernt. Lassen Sie die Segmente am Boden des Rohres absetzen und wiederholen Sie das Spülen in einem zusätzlichen konischen Rohr, das mit Stopplösung gefüllt ist.
- Mechanische Verreibung der Zellsuspension
- Im zweiten Stopp pipettieren Sie das Lösungsspülröhrchen mit einer 1-ml-Pipettenspitze mit breiter Bohrung 10 Mal auf und ab, bis keine großen Gewebesegmente mehr sichtbar sind. Es ist wichtig, eine Übertitution zu vermeiden, um die Zelllyse zu minimieren.
- Pipettieren Sie langsam 300 μl 4%ige BSA-Lösung auf den Boden des konischen 15-ml-Röhrchens, das die Gehirnsegmente enthält. Entfernen Sie vorsichtig die Pipettenspitze, um eine Suspensionsschicht zu erhalten. Zentrifugieren Sie bei 0,4 x g für 3 min. Anschließend wird der Überstand vorsichtig aspiriert und die Zellen in 400 μl Zellkulturmedium resuspendiert.
>5. Plattieren der Zellen
HINWEIS: Erfahrungsgemäß werden etwa 100.000 lebensfähige Zellen pro Embryo gesammelt. 2-3 Monate alte zeitgesteuerte trächtige Mäuse haben typischerweise eine Wurfgröße von 8-10 Embryonen; daher liegt eine grobe Schätzung für die Gesamtausbeute an Zellen pro zeitgesteuerter trächtiger Maus bei etwa 1 Million Zellen.
- Führen Sie mit einem Hämozytometer eine Zellzählung durch und verdünnen Sie die Suspension dann mit einem Zellkulturmedium auf 2.000 Zellen/μl. Zum Mischen kurz trituieren.
- Deckgläser mit Lamininlösung aus Schritt 2 aus dem Inkubator nehmen und die restliche Lamininlösung mit Hilfe eines Vakuums aus den beschichteten Deckgläsern absaugen. Schnell plattieren, um ein vollständiges Austrocknen der Deckgläser zu verhindern. Pipettieren Sie 100 μl (2,0 x 105 Zellen/Deckglas) auf jedes Deckglas und stellen Sie die Petrischalen für 1 h in einen 37 °C Inkubator.
- Geben Sie vorsichtig 3 ml Zellkulturmedium in jede Schale und stellen Sie es wieder in den 37 °C heißen Inkubator. Führen Sie 2 Wochen lang zweimal wöchentlich einen halben bis mittleren Wechsel durch.
>6. Infektion der Zellkultur an 14 DIV mit Adeno-assoziierten viralen (AAV) Vektoren
- Bereiten Sie für jedes Gericht 1 ml serumfreies DMEM-Medium mit 1 μl hSyn-GCaMP6f AAV (1,0 x 1013 Titer) vor
- Aspirieren Sie das Zellkulturmedium aus jeder Schale und ersetzen Sie es durch 1 ml serumfreies DMEM, das hSyn-GCaMP6f enthält. Stellen Sie die Schalen dann für 1 h zurück in den 37 °C heißen Inkubator.
- Aspirieren Sie das serumfreie Medium, das AAVs enthält, und ersetzen Sie es durch 3 ml Zellkulturmedium. Stellen Sie die Schalen wieder in den 37 °C heißen Inkubator. Wir haben festgestellt, dass eine 5-7-tägige AAV-Infektion ein ideales Niveau der GCaMP-Expression ermöglicht. Wechseln Sie während dieser Zeit der Virusinfektion weiterhin alle 2-3 Tage das Medium.
>7. Konfokale Live-Bildgebung von Ca2+ zwischen 19-21 DIV
- Vorbereitung von Aufnahmepuffern
- Um 1 l HEPES-Aufnahmepuffer herzustellen, fügen Sie hinzu: 9,009 g NaCl, 0,3728 g KCl, 0,901 g D-Glukose, 2,381 g HEPES, 2 mL 1 M CaCl 2-Stammlösung und 500 μl 1 M MgCl2-Stammlösung zu 800 mL steril destilliertem H2O. Bringen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,4. Auf ein Endvolumen von 1 l bringen.
- Um 200 ml 20 μM Glutamat-Aufzeichnungspuffer herzustellen, verdünnen Sie 40 μl 100 mM Glutamat-Stammlösung in 200 ml des oben beschriebenen HEPES-Aufzeichnungspuffers.
- Um 200 mL 10 μM NBQX-Aufzeichnungspuffer herzustellen, verdünnen Sie 200 μl 10 mM NBQX-Stammlösung in 200 mL HEPES-Aufzeichnungspuffer
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- Konfokale Bildgebung
- Füllen Sie eine sterile 35-mm-Petrischale mit 3 mL Aufnahmepuffer
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- Eine 35 mm Petrischale mit infizierten Kulturen aus dem 37 °C Inkubator nehmen. Fassen Sie mit einer Pinzette mit feiner Spitze vorsichtig den Rand eines Deckglases und geben Sie es schnell in die mit Aufnahmepuffer gefüllte Petrischale. Legen Sie das restliche Deckglas im Medium zurück in den 37 °C heißen Inkubator. Transportieren Sie die Schüssel mit dem Aufnahmepuffer zum Konfokalmikroskop.
- Starten Sie die Imaging-Software. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, während er initialisiert wird.
- Starten Sie die Peristaltikpumpe und legen Sie die Leitung in den Aufnahmepuffer. Kalibrieren Sie die Durchflussgeschwindigkeit auf 2 ml/min.
- Übertragen Sie das infizierte Deckglas aus der 35 mm Petrischale in das Aufnahmebad.
- Mit dem 10-fachen Wasserimmersionsobjektiv und BF-Licht finden Sie die Fokusebene und suchen nach einer Region mit einer hohen Dichte an Neuronenzellkörpern. Wechseln Sie zum 40-fach-Wasserimmersionsobjektiv und fokussieren Sie die Probe mit BF-Licht neu.
- Wählen Sie im Fenster "Farbstoffliste" in FluoView AlexaFluor 488 aus und wenden Sie es an.
- Die AAV-Expression kann variabel sein. Um eine Überbelichtung und Photobleiche der Fluorophore zu vermeiden, beginnen Sie daher mit niedrigen HV- und Laserleistungseinstellungen. Stellen Sie für den AlexaFluor 488-Kanal die Hochspannung (HV) auf 500, die Verstärkung auf 1x und den Offset auf 0 ein. Stellen Sie für die Laserlinie 488 die Leistung auf 5 % ein. Um das in der Z-Ebene abgebildete effektive Volumen zu vergrößern, erhöhen Sie die Lochblendengröße auf 300 μm. Verwenden Sie die Scanoption "Focus x2", um die Emissionssignale optimal an die Untersättigung anzupassen. Von hier aus können die Einstellungen angepasst werden, bis die ideale Sichtbarkeit jedes Kanals erreicht ist.
Anmerkung: Um den gesamten Bereich der Ca2+-Flüsse mit GCaMP genau zu erfassen, passen Sie die HV- und Laserleistungseinstellungen für die Basislinie an, um eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität zu ermöglichen, ohne den Detektor zu übersättigen.
- Sobald die Mikroskopeinstellungen optimiert sind, bewegen Sie den Tisch, um eine Region mit mehreren Zellen zu lokalisieren, die spontane Änderungen der GCaMP6f-Fluoreszenz aufweisen, und fokussieren Sie auf die gewünschte Ebene für die Bildgebung.
- Verwenden Sie das Werkzeug "Rechteck beschneiden", um den Bildrahmen auf eine Größe zu beschneiden, die ein Bildintervall von knapp 1 Sekunde erreichen kann. Dies ist notwendig, um das Bildintervall auf 1 Bild pro Sekunde einzustellen.
- Setzen Sie das Fenster "Intervall" auf den Wert 1,0 und das Fenster "Num" auf 600.
Anmerkung: Um verschiedene Aufzeichnungspuffer zum gewünschten Zeitpunkt (300 s) zu liefern, ist es wichtig, die Latenz der Pumpe zu kalibrieren, um die neue Lösung in das Bad zu bringen. Dies hängt von der Perfusionsrate der Lösung (2 ml/min) und der Länge der Leitung ab, die zum Pumpen der Lösung verwendet wird.
- Um einen Film der T-Serie aufzunehmen, wählen Sie die Option "Zeit" und verwenden Sie dann die Scanoption "XYt", um mit der Aufnahme zu beginnen.
- Beobachten Sie den Fortschrittsbalken der Bildgebung und verschieben Sie die Leitung zum richtigen Zeitpunkt vom HEPES-Aufzeichnungspuffer in den 20-μM-Glutamat-Aufzeichnungspuffer (z. B. wenn die Latenz der Pumpe so kalibriert ist, dass sie bei 60 s eine Lösung liefert, verschieben Sie die Leitung bei 240 Bildern in den Glutamatpuffer, um Glutamat bei 300 s abzugeben).
- Wenn die Bildbearbeitung abgeschlossen ist, wählen Sie die Schaltfläche Serie Fertig aus, und speichern Sie den fertigen Film der T-Serie. Fahren Sie mit der Perfusion von 20 μM Glutamat für weitere 5 Minuten fort, so dass die kultivierten Neuronen insgesamt 10 Minuten lang Glutamat ausgesetzt waren. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Deckglas, das abgebildet werden soll.
- Nach der zusätzlichen 5-minütigen Exposition mit 20 μM Glutamat nehmen Sie das Deckglas aus dem Bad und legen Sie es wieder in die 35-mm-Petrischale mit dem Aufnahmepuffer, bis der Tag der Bildgebung abgeschlossen ist.