Vorbereitung von rhinalen Cortex-Hippocampus-Schnitten aus dem Gehirn eines Rattenwelpen

Zusammenfassung

Quelle: Valente, C. A., et al., Ein Modell der Epileptogenese in rhinalen Cortex-Hippocampus Organotypischen Schnittkulturen. J. Vis. Exp. (2021)

Das Video zeigt eine Methode, um rhinale Cortex-Hippocampus-Schnitte aus dem Gehirn eines Rattenwelpen zu gewinnen und sie in membranösen Inserts innerhalb einer mit Medien gefüllten Multiwell-Platte für die weitere Analyse zu kultivieren.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.

>1. Vorbereitung von rhinalen Cortex-Hippocampus-Schnitten

HINWEIS: Für die Herstellung von rhinalen Cortex-Hippocampus-Schnitten werden P6-7 Sprague-Dawley-Ratten verwendet.

1. Aufbau der Kultur und Vorbereitung des Mediums
   1. Bereiten Sie am Tag vor der Kultur die benötigten Medien vor und stellen Sie sie auf 4 °C.
   2. Bereiten Sie das Seziermedium vor: 25 mM Glukose in Gey's Balanced Salt Solution (GBSS).
   3. Nährmedium vorbereiten: 50 % Opti-MEM, 25 % HBSS, 25 % Pferdeserum (HS), 25 mM Glukose, 30 μg/ml Gentamycin.
   4. Erhaltungsmedium vorbereiten: Neurobasal-A (NBA), 2 % B27, 1 mM L-Glutamin, 30 μg/ml Gentamycin, HS (15 %, 10 %, 5 % und 0 %).
2. Brain-Harvesting
   1. Geben Sie kurz vor Beginn der Kultur 1,1 ml Nährmedium mit einer P1000-Pipette in jede Vertiefung der 6-Well-Platte und stellen Sie sie auf 37 °C.
   2. Legen Sie alle Geräte (Präpariermikroskop, Gewebezerkleinerer, Präparierlampe, Präparierwerkzeuge, Elektroden, Platten, Einsätze und Filterpapiere) in die biologische Sicherheitswerkbank und sterilisieren Sie sie 15 Minuten lang unter UV-Licht.
   3. Stellen Sie die Schichtdicke auf 350 μm ein.
   4. GBSS aus dem Kühlschrank nehmen. Geben Sie 5 ml GBSS in sechs Petrischale. Pro Tier werden sechs Petrischalen benötigt.
   5. Euthanasiere den Rattenwelpen. Führen Sie die Enthauptung mit einer scharfen Schere an der Basis des Hirnstamms des Tieres durch.
   6. Waschen Sie den Tierkopf dreimal in kaltem GBSS und bringen Sie ihn in den Sicherheitsschrank.
3. Gewebeisolierung und Vorbereitung von Scheiben
   1. Führen Sie eine scharfe Pinzette fest in die Augenhöhlen ein, um den Kopf zu halten.
   2. Schneiden Sie mit einer dünnen Schere die Haut/Kopfhaut entlang der Mittellinie beginnend vom Foramen vertebrale in Richtung der Frontallappen und legen Sie sie beiseite.
   3. Schneiden Sie auf die gleiche Weise wie der Schädel und entlang der zerebralen Querfissur (Raum zwischen Gehirn und Kleinhirn). Bewegen Sie die gebogene lange Pinzette auseinander.
   4. Entsorgen Sie die Riechkolben mit einem Spatel. Entnehmen Sie das Gehirn aus dem Kopf und legen Sie es mit der Rückenfläche nach oben in ein eiskaltes GBSS (Abbildung 1A).
   5. Führen Sie die feine Pinzette in das Kleinhirn ein und gehen Sie mit dem Spatel entlang der Mittellinie, um jede Hemisphäre sehr vorsichtig zu öffnen (Abbildung 1B).
   6. Entfernen Sie mit einer kurzen Kurvenzange vorsichtig das überschüssige Gewebe, das die Hippocampus bedeckt, ohne die Hippocampusstruktur zu berühren. Schneiden Sie dann mit einem Spatel unter jeden Hippocampus (Abbildung 1C).
   7. Nehmen Sie eine Halbkugel und legen Sie sie mit dem Hippocampus nach oben auf ein Filterpapier. Wiederholen Sie den Vorgang mit der anderen Hemisphäre und legen Sie sie parallel zur ersten in das Filterpapier. Legen Sie das Filterpapier mit den Halbkugeln senkrecht zur Klinge auf den Gewebezerkleinerer und schneiden Sie die Halbkugeln in 350 μm große Scheiben (Abbildung 1D).
   8. Legen Sie das geschnittene Gewebe in eine Petrischale mit kaltem GBSS (Abbildung 1E).
   9. Trennen Sie die Scheiben vorsichtig mit den Elektroden mit runder Spitze (Abbildung 1F). Behalten Sie nur die Scheiben mit einer strukturell intakten Rinde und Hippocampus. Die DG- und CA-Bereiche sollten perfekt definiert sein, ebenso wie der entorhinale und perirhinale Kortex (Abbildung 1G).
   10. Legen Sie jede Scheibe mit einem Spatel und einer Elektrode mit runder Spitze auf den Einsatz (Abbildung 1H-I). Entfernen Sie das überschüssige Dissektionsmedium um jede Scheibe herum mit einer P20-Pipette (Abbildung 1J). Vier rhinale Cortex-Hippocampus-Schnitte können in einem einzigen Insert kultiviert werden (Abbildung 1K).
4. Kulturpflege
   1. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag.
   2. Das Medium auf 37 °C erwärmen.
   3. Nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator. Nehmen Sie jeden Einsatz auf, indem Sie die Kunststoffkante mit einer Pinzette festhalten (Abbildung 1L).
   4. Verwenden Sie eine freie Hand, um das Medium aus der Vertiefung zu aspirieren. Setzen Sie den Einsatz wieder in die Vertiefung ein und fügen Sie mit einer P1000-Pipette 1 ml frisches, erwärmtes Medium hinzu (Abbildung 1M). Wiederholen Sie den Vorgang für alle Einfügungen. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen zwischen der Membran und dem Medium eingeschlossen sind.

Ergebnisse

Abbildung 1: Detailliertes Verfahren zur Präparation von organotypischen Schnitten aus dem rheinischen Kortex-Hippocampus. (A) Entfernen Sie das Gehirn aus dem Kopf und legen Sie es mit der Rückenfläche nach oben in ein eiskaltes GBSS. (B) Führen Sie die Pinzette in das Kleinhirn ein. Öffnen Sie das Gehirn durch die Mittellinie und entfernen Sie das überschüssige ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Klingen für Skalpellgriff	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Artikel-Nr.: 10011-00
-/Gewebe-Scheibenkammer-System	Warner Instruments
Zellkultureinsätze, 30 mm, hydrophiles PTFE	Millipore SAS	PICM03050
Konventioneller Inkubator	Thermo Scientific Heraeus	BB15, Funktionslinie	Eingestellt auf 37 °C und 5 % CO2
D(+)-Glukose-Monohydrat	Merck Millipore	Artikel-Nr.: 1.08342.1000
D-(+)-Glukoselösung, 45% in Wasser	Sigma	Nr. G8769
di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat	Merck Milipore	Artikel-Nr.: 1.06580.1000
Dumont #5 Feine Pinzette Biologie Inox	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 11254-20
Dumont #5 Pinzette Standard Inox	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 11251-20
Dumont #7 Pinzette Standard Dumoxel	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 11271-30
Dumont Medical #7S Pinzette Short Curve Inox	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 11273-22
Gentamycin-Stammlösung, 50 mg/ml	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 15750-037
Geys ausgewogene Salzlösung (GBSS)	Biologische Industrien	01-919-1A
Glas-Elektroden	Wissenschaftliche Produkte	GB150F-10	Runde Spitzen selbstgemacht
Glas-Pasteur-Pipetten, 230 mm	VWR Deutschland	Nr. 612-1702
Pferdeserum, hitzeinaktiviert (HS)	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 26050-088
Irisspatel gebogen	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 10092-12
Biologische Sicherheitswerkbank der Laborkulturklasse II	HERASafe	HS 12
L-Glutamin Lösung 200 mM (Q)	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 25030-024
Neurobasal-A Medium (NBA)	Thermo Fisher Scientific	Tel.: 10888-022
Opti-MEM® I Reduziertes Serummedium	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 31985-047
Platin 5 Klingen	Gillette
Qualitatives Filterpapier, Zellulose, Güteklasse 1, 55 mm	Whatman	Nr. 1001-055	Mittlerer Rückhalt 11μm
Qualitatives Filterpapier, Zellulose, Güteklasse 1, 90 mm	Whatman	Nr. 1001-090	Mittlerer Rückhalt 11μm
Skalpell-Griff	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Artikel-Nr.: 91003-12
TC-behandelte sterile 6-Wells-Platten	Corning	CORN3516
Temperaturregler	MEDICAL SYSTEMS CORP.	TC-102
Zerkleinerer für Gewebe	Das Mickle Laboratory Engineering CO. LTD.	MTC/2	Auf 350 μm eingestellt