Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Isolierung, Kultur und Stimulation von NK-Zellen
- Erzeugung eines intakten Nozizeptor-Neurons (Wurfgeschwisterkontrolle; TRPV1wt::D TAfl/wt) und ablierte (TRPV1cre::D TAfl/wt) Mäuse durch Kreuzung von Lox-Stop-Lox-Diphtherie-Toxin-Mäusen (DTAfl/fl) mit TRPV1cre/wt-Mäusen.
- Mit CO2-Inhalation euthanasieren Sie eine naive Wurfgeschwister-Kontrollmaus (TRPV1wt::D TAfl/wt).
- Entnehmen Sie die Milz in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 μl steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Homogenisiere die Milz mit einem Stößel.
- Verdünnen Sie die Zellen mit 1 ml sterilem PBS.
- Filtrieren Sie die Mischung durch ein 50-μm-Zellsieb in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
- Füllen Sie das Volumen (10 ml) mit sterilem PBS auf.
- Sammeln Sie 10 μl und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
- Die Zellen zentrifugieren (500 × g, 5 min) und den Überstand entfernen.
- Resuspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von 108 Zellen/ml in einem supplementierten RPMI 1640-Medium.
- Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um Milzzellen mit natürlichem Killer (NK) mit einem NK-Zellisolationskit der Maus magnetisch zu reinigen. Bestätigen Sie die Reinheit der NK-Zellen mit Hilfe der Durchflusszytometrie.
- Sammeln Sie 10 μl und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
- Die Zellen zentrifugieren (500 × g, 5 min) und den Überstand entfernen.
- Resuspendieren Sie die NK-Zellen in einem supplementierten RPMI 1640-Kulturmedium (enthält IL-2 und IL-15).
- Kultivieren Sie 2 × 106 NK-Zellen/ml in einer 96-Well-U-Bodenplatte für 48 Stunden.
>2. DRG-Neuronenisolierung und -kultur
- 24 Stunden vor dem Ende der NK-Zellstimulation (Schritt 1.15) wird eine 96-Well-Platte mit 100 μl/Well Laminin (1 ng/ml) beschichtet und 45 min (37 °C) inkubiert.
- Entfernen Sie nach der Inkubation die Lösung und lassen Sie die Vertiefungen in einer Biosicherheitswerkbank an der Luft trocknen.
Mit - CO2-Inhalation das Nozizeptor-Neuron intakt einschläfern (Wurfgeschwisterkontrolle; TRPV1wt::D TAfl/wt) oder ablierte (TRPV1cre::D TAfl/wt) Mäuse.
HINWEIS: Die CO2-Inhalation wird der zervikalen Luxation vorgezogen, da sie eine Störung der Spinalnerven vermeidet, die mit dem DRG (Spinalganglion) verbunden sind.
- Befestigen Sie die Maus in Bauchlage auf dem Brett, heben Sie die Haut an und schneiden Sie die Haut entlang der Rückensäule ein.
- Schneiden Sie das Lendengelenk ab und trennen Sie mit einer Schere das Kreuzbein von der Lendenwirbelsäule.
- Trennen Sie die Wirbelsäule, indem Sie die Muskeln und Rippen auf beiden Seiten der Wirbelsäule in Schädelrichtung durchschneiden, bis die Schädelbasis erreicht ist.
- Schneiden Sie mit einer Schere die Wirbelsäule am Atlanto-Hinterhaupt-Gelenk ab.
- Entfernen Sie Muskel- und Fettgewebe von der Wirbelsäule.
- Stecken und öffnen Sie die Wirbelsäule, um das Rückenmark zu entfernen und Zugang zum DRG zu erhalten. Suchen Sie nach dem DRG in den Foramina intervertebralis, die über die Rückenwurzel mit dem Rückenmark verbunden sind, aber von den Hirnhäuten getrennt sind.
- Ernten Sie die DRGs in ein konisches 15-ml-Röhrchen, das mit 10 mL eiskaltem, zugesetztem DMEM gefüllt ist.
- Das Präparat zentrifugieren (200 × g, 5 min, Raumtemperatur) und den Überstand entfernen.
- Fügen Sie 250 μl PBS hinzu, das Kollagenase IV (1 mg/ml) und Dispase II (2,4 U/ml) enthält.
- Inkubieren Sie das DRG mit Kollagenase IV/Dispase II (C/D)-Lösung (80 min, 37 °C, leichtes Rühren). Wenn Sie Ganglien von mehreren Mäusen poolen, halten Sie ein Verhältnis von 125 μl C/D-Lösung pro Ganglion ein.
- Um die Enzyme zu inaktivieren, fügen Sie 5 ml supplementiertes DMEM-Medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium) hinzu.
- Die Lösung zentrifugieren (200 × g, 5 min) und den Überstand vorsichtig mit einer Pipette entfernen.
- Um unerwünschten Zellverlust zu vermeiden, lassen Sie ~100 μL des Überstands.
- Fügen Sie 1 ml supplementiertes DMEM-Medium hinzu.
- Mit einer Pipettenpistole und drei Pasteur-Glaspipetten abnehmender Größe das DRG vorsichtig (~10 nach oben/unten pro Pasteur-Pipettengröße) zu einer Einzelzellpräparation zerkleinern.
- In einer Biosicherheitswerkbank Rinderserumalbumin (BSA) in sterilem PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) auf eine Endkonzentration von 15 % verdünnen. 1 ml Aliquots bei -20 °C lagern.
- Erzeugen Sie einen BSA-Gradienten in einem konischen 15-ml-Röhrchen, indem Sie 2 mL steriles PBS hinzufügen und langsam 1 mL 15%ige BSA-Lösung am Boden des Röhrchens abgeben. Vermeiden Sie eine Störung des Gradienten, indem Sie die Pipette vorsichtig entfernen.
- Pipettieren Sie mit einer P200-Pipette langsam die verreibte Gangliensuspension (die die Neuronen enthält) auf die Seite des Röhrchens in den Gradienten.
- Zentrifugieren Sie den neuronenhaltigen BSA-Gradienten (200 × g, 12 min, Raumtemperatur). Stellen Sie die Beschleunigung und Verzögerung der Zentrifuge auf die Mindestdrehzahl ein.
HINWEIS: Nach der Zentrifugation befinden sich die Neuronen am Boden des Röhrchens, während die Zelltrümmer im BSA-Gradienten eingeschlossen werden.
- Entfernen Sie vorsichtig den gesamten Überstand mit einer Pipette.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μl Neurobasal.
- Platte 104 Neuronen pro Vertiefung (200 μl neurobasal/Vertiefung) in einer lamininbeschichteten 96-Well-Platte mit flachem Boden.
HINWEIS: Im Durchschnitt kann ein Untersucher ~8 Vertiefungen pro Maus füllen.
- Kultivieren Sie die Neuronen (37 °C, über Nacht), um eine Bindung zu ermöglichen.
>3. Co-Kultur
- Entfernen Sie langsam das Neurobasal aus der Neuronenkultur.
- Nach 48-stündiger Stimulation mit IL-2 und IL-15 (siehe Schritte 1.14-1.15) resuspendieren Sie die NK-Zellen und geben Sie 105 NK-Zellen/Well in die Neuronenkultur (96-Well-Platte mit flachem Boden).
HINWEIS: Im Durchschnitt kann der Untersucher ~6 Vertiefungen pro Maus füllen.
- Co-Kultur der Zellen in supplementiertem neurobasalem MX (37 °C, 48 h).
