Isolierung und Kultivierung von primären embryonalen Dopamin-Neuronen aus dem Mittelhirn der Maus

Alle Verfahren zur Probenentnahme wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

1. Zubereitung

1. Bereiten Sie Dopamin-Neuronen-Medium (DPM) mit 0,46 % D-Glucose, 1 % L-Glutamin, 1 % N2 und 0,2 % Primocin vor, ergänzt mit Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium/Nährstoff-Gemisch F-12 (DMEM/F12). Filtern Sie den DPM, nachdem Sie die Zutaten gemischt haben. DPM bei 4 °C lagern und jedes Aliquot nur einmal erwärmen.
   HINWEIS: DPM sollte keinen Gliazelllinien-abgeleiteten Wachstumsfaktor (GDNF) enthalten, da er die Akkumulation von α-Synuclein in Dopamin-Neuronen reduziert.
2. Bereiten Sie silikonisierte Glaspipetten vor, die extrem hydrophob sind, um die Anhaftung an der Oberfläche und den Verlust von Zellen bei der ersten Handhabung embryonaler Neuronen zu minimieren.
   1. 10 ml Silikonisierungsflüssigkeit zu 1 l destilliertem Wasser geben und unter Rühren in einem 2-Liter-Gefäß mischen. Lassen Sie die Glaspipetten 15 Min. lang in die Silikonisierungslösung eintauchen.
   2. Spülen Sie die Pipetten 3–5x mit destilliertem Wasser aus. Trocknen Sie die Pipetten über Nacht bei Raumtemperatur (RT) oder 1-2 h bei 100-120 °C beheiztem sterilen Raum, um die Trocknung zu beschleunigen.
   3. Sterilisieren Sie die Pipetten durch Standardautoklavieren in einem versiegelten Autoklavenbeutel.
3. Bereiten Sie mit Poly-L-Ornithin (PO) beschichtete 96-Well-Platten mit transparentem Boden vor, indem Sie 60 μl PO-Lösung in die mittleren Vertiefungen der 96-Well-Platte geben, die für die Aussaat der Neuronen verwendet werden sollen, wobei mindestens eine Reihe/Spalte mit Vertiefungen an den Rändern der Platte verbleibt, um Kanteneffekte zu vermeiden. Bewahren Sie die beschichtete Platte über Nacht bei 4 °C oder 4 h bei RT auf.
4. Vor dem Plattieren der Zellen wird PO vollständig aspiriert und die Zellen dreimal mit 100 μl 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Aspirieren Sie 1x PBS aus den Vertiefungen und halten Sie den Deckel der Platte zum vollständigen Trocknen offen.
   HINWEIS: Es ist möglich, gebrauchte Bestellungen zu sammeln und für die Wiederverwendung zu filtern. Dies kann für dieselbe Bestelllösung zweimal wiederholt werden.
5. Geben Sie 50 μl DPM in die zuvor beschichteten Vertiefungen. Aspirieren Sie DPM mit einer 100-μl-Kunststoffspitze aus den Vertiefungen und kratzen Sie gleichzeitig den Boden der Vertiefung mit kreisenden Bewegungen an, um die Beschichtung am Umfang jeder Vertiefung zu entfernen. In der Mitte des Bohrlochs verbleibt eine PO-beschichtete Insel.
6. Geben Sie unter einer laminaren Haube 10 μl DPM in die Mitte jeder beschichteten Insel, um Mikroinseln zu erzeugen.
   HINWEIS: Eine Platte mit DPM-bedeckten Mikroinseln kann während der Isolierung von Zellen 1–2 Stunden lang unter der Laminar-Flow-Haube aufbewahrt werden

2. Isolierung des ventralen Mittelhirnbodens aus embryonalen Mausembryonen am Tag 13.5 (E13.5)

1. Füllen Sie vor dem Sezieren eine 10 cm große Petrischale mit Dulbecco-Puffer und stellen Sie sie auf Eis.
2. Euthanasieren Sie eine E13.5-trächtige weibliche Maus gemäß den Richtlinien der Einrichtung. Legen Sie die Maus flach auf den Rücken und besprühen Sie den vorderen Körper mit 70% Ethanol. Heben Sie die Haut mit einer Pinzette über die Gebärmutter und machen Sie einen Schnitt mit einer chirurgischen Schere, um die Gebärmutter freizulegen.
3. Entfernen Sie vorsichtig die Gebärmutter und legen Sie sie in die zuvor vorbereitete Petrischale auf Eis.
4. Entnehmen Sie mit einer chirurgischen Schere unter der laminaren Haube bei RT vorsichtig die Embryonen aus der Gebärmutter. Entfernen Sie alle Plazentareste mit einer Pinzette von den Embryonen und legen Sie sie in eine neue 10 cm Petrischale, die mit Dulbecco-Puffer gefüllt ist.
5. Schneiden Sie mit einer Präparierzange oder einer Nadel das Hinterviertel des Kopfes an den Stellen ab, die in Abbildung 1A mit schwarzen Pfeilen markiert sind. Nehmen Sie das abgeschnittene Stück vom Rest des Embryos weg (Abbildung 1B).
6. Legen Sie den hinteren Teil des geschnittenen Stücks in Richtung des Betrachters (Abbildung 1C) und schneiden Sie es vorsichtig von kaudal nach kranial auf (Abbildung 1D). Schneiden Sie 0,5 mm unterhalb der Schädelöffnung einen 2 mm² –3 mm² Bereich, wie in Abbildung 1E gezeigt.
7. Sammeln Sie den ventralen Mittelhirnboden (siehe Abbildung 1F) in einem leeren 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie das Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis, bis sich alle Mittelhirnböden darin angesammelt haben.
   HINWEIS: Alternativ können die Mittelhirnböden mit einer 1 ml-Mikropipette nach der Dissektion aller Embryonenhirne entnommen werden.

3. Etablierung primärer embryonaler Mittelhirnkulturen aus E13.5-Mausembryonen im 96-Well-Plattenformat

1. Nach der Entnahme der Mittelhirnböden aller Embryonen im selben 1,5-ml-Röhrchen entfernen Sie den restlichen Dulbecco-Puffer und waschen Sie die Gewebestücke dreimal mit 500 μl Ca2⁺, Mg2⁺-freier Hank's Balanced Salt Solution (HBSS).
2. Entfernen Sie HBSS und geben Sie 500 μl 0,5 % Trypsin in das Röhrchen. Inkubieren Sie es bei 37 °C für 30 Minuten.
3. Während der Inkubation werden 1,5 ml fötales Rinderserum (FBS) bei 37 °C erwärmt, 30 μl DNase I in das FBS gegeben und gemischt. Polieren Sie außerdem die Spitze einer Pipette aus silikonisiertem Glas. Stellen Sie sicher, dass das Loch keine scharfen Kanten aufweist und etwa so groß ist wie eine 1-ml-Mikropipettenspitze.
   HINWEIS: Alternativ kann eine 1-ml-Mikropipettenspitze mit geringer Adhäsion für die Verreibung verwendet werden. Silikonisierte Glaspipetten scheinen jedoch die besten Ergebnisse zu liefern.
4. Sobald die Inkubation in Schritt 3.2 beendet ist, geben Sie 500 μl des FBS/DNase-Gemisches in das teilweise verdaute Gewebe. Verwenden Sie die Glaspipette, um das Gewebe in der FBS/Trypsin-Mischung zu zerreiben. Zerreiben, bis das Gewebe in winzige, kaum sichtbare Partikel zerfällt. Vermeiden Sie Blasen während der Verreibung.
5. Lassen Sie die übrig gebliebenen Partikel am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens durch die Schwerkraft ausfällen. Ohne den Niederschlag am Boden zu pipettieren, den Überstand in ein leeres konisches 15-ml-Polypropylen-Röhrchen auffangen.
6. FBS/DNase I aus Schritt 3.3 (98:2) mit 1.000 μl HBSS verdünnen, um FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50) zu erhalten. Mischen Sie, indem Sie auf und ab pipettieren. Geben Sie 1.000 μl der neuen Mischung zu den übrig gebliebenen Partikeln im Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie das Zerreiben und wiederholen Sie Schritt 3.5.
7. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt noch einmal, um alle FBS/DNase-I/HBSS aufzubrauchen (49:1:50).
8. Sobald der gesamte Überstand im 15-ml-Röhrchen gesammelt ist (aus den Schritten 3.5, 3.7 und 3.8), verwenden Sie eine Tischzentrifuge, um den Überstand (~3 ml) bei 100 x g für 5 Minuten nach unten zu schleudern. Entfernen Sie den Überstand, ohne die pelletierten Zellen am Boden zu berühren.
9. Waschen Sie das Zellpellet, indem Sie 2 mL DPM in das Röhrchen geben und es 5 Minuten lang bei 100 x g herunterschleudern. Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie das Waschen 2x, um den Schmutz in den pelletierten Zellen zu minimieren.
   HINWEIS: Verwenden Sie immer frisches, erwärmtes DPM für die kultivierten Neuronen. Für die Waschschritte muss DPM nicht frisch sein, sondern sollte auf 37 °C vorgewärmt werden.
10. Verdünnen Sie die Zellen mit frischem, warmem DPM und geben Sie sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Die Menge an DPM für die Verdünnung hängt von der Anzahl der Embryonen ab, die für die Gewebedissektion verwendet werden. Verwenden Sie zum Beispiel 150 μl DPM, um die Zellen von zehn Embryonen zu verdünnen.
11. Übertragen Sie 10 μl Zellen in DPM in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Mischen Sie sie mit 10 μl 0,4 % Trypanblau-Fleck. Zählen Sie lebende (d.h. Trypanblau negativ) Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
    HINWEIS: Verwende 30.000 Zellen für die Beschichtung pro Vertiefung, um ~1.000 Dopamin-Neuronen pro Vertiefung zu erhalten. Wenn die Zelldichte höher als ~30.000 Zellen pro 6 μl ist, verdünnen Sie die Zellen vor dem Plattieren weiter mit DPM, so dass das Aussaatvolumen nicht weniger als 6 μl beträgt.
12. Ohne den Boden der Vertiefungen zu berühren, entfernen Sie den DPM von den Mikroinseln, die in Schritt 1.6 erstellt wurden.
13. Um eine reproduzierbare Zelldichte in jeder Vertiefung zu erhalten, mischen Sie die Zellen durch sanftes Pipettieren vor dem Plattieren in der Vertiefung. Geben Sie mit einer Mikropipette von 1 bis 10 μl 6 μl Zellen in die Mitte der Vertiefung, an der Stelle jeder ehemaligen Mikroinsel.
14. Füllen Sie die leeren Vertiefungen an den Rändern der Platte mit 150 μl Wasser oder 1x PBS, um die Verdunstung aus den Vertiefungen mit neuronalen Kulturen zu minimieren. Die Platte wird in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ 1 h inkubiert.
15. Nehmen Sie nach 1 h die Platte aus dem Inkubator, geben Sie 100 μl DPM in jede Vertiefung mit den Zellen und setzen Sie sie wieder in den Inkubator ein.
16. Zwei Tage nach der Beschichtung (Tag in vitro 2 oder DIV2) entfernen Sie 25 μl und fügen Sie 75 μl frisches DPM hinzu, um das endgültige Medienvolumen auf 150 μl zu bringen und Verdunstung so weit wie möglich zu vermeiden.
17. Tauschen Sie die Hälfte des Mediums gegen frisches DPM aus (d. h. entfernen Sie 75 μl und fügen Sie 75 μl frisches DPM hinzu) bei DIV5. Führen Sie nach DIV5 keine Medienwechsel mehr durch.

Abbildung 1: Dissektion des Mittelhirnbodens von einem E13.5-Mausembryo. (A) Die Schnittstellen an der Hinterhand des Kopfes sind mit schwarzen Pfeilen und weißen gestrichelten Linien markiert. (B) Das Stück wurde aus dem Rest des Embryos entfernt. Das entnommene Stück wird eingekreist. (C) Das Stück wurde um 90° gedreht, so dass es dem Betrachter zugewandt ist. (D) Die Arbeit wurde von den schwarzen Pfeilen aus geöffnet, von kaudal nach kranial (markiert mit weißer gestrichelter Linie). (E) Von 0,5 mm bis 1 mm unterhalb der Öffnung wurde der Bereich von 2 mm2 –4 mm2 geschnitten (mit schwarzen Linien markiert). (F) Der ventrale Mittelhirnboden wurde isoliert (markiert mit schwarzem gestricheltem Quadrat). Maßstabsleisten = 1 mm.