Dissektion und Montage von Explantaten aus Fruchtfliegenlarven

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Präparieren und Montieren von Larven-Hirnexplantaten

1. Präparieren Sie das Gehirn der Larven in der physiologischen externen Kochsalzlösung (120 mM NaCl, 4 mM MgCl₂, 3 mM KCl, 10 mM NaHCO₃, 10 mM Glukose, 10 mM Saccharose, 5 mM N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-2-aminoethansulfonsäure (TES), 10 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES), 2 mM Ca²⁺, pH 7,2) unter einem Dissektionsmikroskop (4,5-fache Vergrößerungsleistung) mit zwei Paaren #5 Standard-Dissektionszange (11 cm). Verwenden Sie eine Pinzette, um den Larvenkörper an Ort und Stelle zu halten, und die andere, um das Gehirn vorsichtig zu präparieren. Schonen Sie die Augenscheiben, die Hirnlappen und den ventralen Nervenstrang. Entfernen Sie anhaftende Muskeln, um die Bewegungen der Probe während der Bildgebung zu minimieren.
2. Bereiten Sie einen Objektträger (25 x 75 x 1,0 mm³) vor und ziehen Sie mit einer Spritze eine quadratische Kammer mit Vakuumfett
.
3. 20 μl externe Kochsalzlösung in die quadratische Kammer mit Fettsperren geben.
4. Übertragen Sie die präparierten Larvenhirne mit einer Pinzette in die Kammer auf dem Objektträger. Passen Sie die Position des Gehirns unter dem Präparierbereich an, um sicherzustellen, dass die Rückenseite nach oben zeigt.
5. Decken Sie die Kammer mit einem Glasdeckglas (22 x 22 x 0,15 mm³) ab. Das Larvenhirn wird nun auf dem Objektträger in einer Kammer montiert, die mit der externen Kochsalzlösung gefüllt ist (Abbildung 1B).
   Anmerkung: Durch sanften Druck auf das Deckglas wird das Gehirn eingeengt und das Abdriften der Probe in der anschließenden Bildgebungssitzung reduziert.

Abbildung 1: Arbeitsablauf des Protokolls zur Bildgebung und Quantifizierung der Dendritendynamik. (A) Das Protokoll umfasst sechs Schritte, die die Probenvorbereitung, die Bildentnahme, die Bildverarbeitung und die halbautomatische Quantifizierung der Dendritendynamik abdecken. (B) Ein schematisches Diagramm, das eine bildgebende Kammer zeigt, die ein Larven-Hirnexplantat enthält, das mit der dorsalen Seite nach oben montiert ist. Das Explantat des Gehirns hat in jedem Lappen ein individuell markiertes ventrales laterales Neuron (LNv) und ist in die externe Kochsalzlösung eingetaucht. Die Vakuum-Fettbarrieren tragen das Gewicht des Deckglases und bilden eine kleine Kammer, die verhindert, dass sich das Gehirn bewegt.