توقف القلب والإنعاش القلبي Normothermic : نموذج الفأر من نقص التروية ، إعادة إشباع الخلايا الإصابات

Summary

ويقدم نموذجا قويا للرعاية الحرجة والمتعلقة المحيطة بالجراحة إصابة الكلى الحاد. به الجسم كله نقص انسياب الدم الناجم عن السكتة القلبية من الممكن تكرار ما يقرب من التغيرات النسجية والوظيفي للآكي السريرية.

Abstract

إصابة الكلى الحاد (آكي) هو مشترك ، قاتلة للغاية ، من مضاعفات الأمراض الخطيرة التي لديها ارتفاع معدل الوفيات ^1-4 والتي تسببت في معظم الأحيان عن طريق نقص انسياب الدم كامل الجسم. ^5،6 الاستنساخ الناجح لكامل الجسم نقص انسياب الدم في نماذج القوارض وقد محفوف بالصعاب. ^7-9،9،10 المجموعات البؤرية التي توظف الإسكيمية أثبتت مرارا وتكرارا النتائج التي لا تترجم إلى الإعداد السريرية ، والنماذج الحيوانية الكبيرة التي تسمح لكامل الجسم نقص انسياب الدم يفتقرون إلى مجموعة أدوات كاملة من التلاعب الجيني ممكن في الماوس. ^11،12 ومع ذلك ، في السنوات الأخيرة برز نموذج الفأر من السكتة القلبية والإنعاش القلبي والتي يمكن تكييفها لآكي نموذج ¹³ يستنسخ هذا النموذج موثوق فيزيولوجي ، والنتائج الفنية ، والتشريحية ، وينظر في نسيجية آكي السريرية ، يتم تكرارها بسرعة ، ويقدم كل من مزايا كبيرة من طراز جراحية الفئران ، بما في ذلك الوصول إلى التقنيات الجينية الاستغلالية ، وانخفاض التكلفة النسبية للحيوانات الكبيرة ، وسهولة الاستخدام. وقد وضعت مجموعتنا خبرة واسعة في استخدام هذا النموذج لتقييم عدد من الجهاز نتائج محددة في AKI. ^14،15

Protocol

وتجرى جميع الإجراءات المذكورة وفقا لالمعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات في البحوث وتمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوانية من اوريجون للصحة ورعاية الحيوان في جامعة العلوم واللجنة المؤسسية الاستخدام.

1. تحضير جراحي

1. وزن الماوس. يتم تنفيذ الإجراء الموضح على الفئران C57BL / 6 وزنها بين 20 و 25 غرام. هو تخدير يتسبب في خانة التحريض به 3-4 ٪ isoflurane ، وحافظت في وقت لاحق باستخدام 1،5-2،5 ٪ isoflurane في الهواء / الأوكسجين الخليط.
2. عيون وتليين موقف مستلق على الحيوان وسادة التدفئة. 4 شل أطرافه باستخدام الشريط. قد تكون مسجلة في الكفوف الخلفيتين في موقف محايد ، ولكن ينبغي تأمين forepaws أقرب إلى جدار الصدر ممكن للسماح كامل جدار الصدر أثناء رحلة الضغط على الصدر.
3. تليين ووضع مسبار الحرارة المستقيم. يتم التحكم في درجة الحرارة باستخدام لوحة التدفئة ومصباح متصلا إلى وحدة تحكم في درجة الحرارة الالكترونية (DIGI - تحسس ، كول Parmer ، فيرنون هيلز IL) ، وهو يحدد للحفاظ على 37،0 درجة مئوية. لأنه من الممكن أن تدرج ضمن درجة حرارة الحيوان يمكن أن تتطور خلال حالة عدم التدفق ، فمن المهم أن تقاس درجة الحرارة والتحكم بالقرب من جهاز من الفائدة.
4. Intubate القصبة الهوائية باستخدام 2.5 سم 22 القسطرة تفلون GA (Insyte - W ، BD ، فرانكلين نيوجيرسي) ونهاية خفض القاصية من introducer الزاوية (Frova Introducer ، الطبي كوك ، بلومينغتون IN). أساليب أخرى من التنبيب الرغامي مقبولة ، ومع ذلك ، واستخدام الزاوية جهة التعريف يسمح لتحديد المواقع المناسبة من الرقبة في وضع يسمح بتمديد قليلا ، والذي يحسن التعرض الجراحية لوضع القسطرة الوريدية. يتم تأمين مركز القسطرة الرغامي مع حلقة من الدرز إلى القاطعة وصيانتها مع التوتر لشل حركة طفيفة في الرأس خلال الضغط على الصدر.
5. تهوية ميكانيكيا الماوس مع جهاز التنفس الصناعي القوارض لتعيين 140 ميكرولتر ، الأنفاس 150 / دقيقة. لم يتم ضبط هذا لوزن كما هو دائما تنفيذ هذا البروتوكول في الحيوانات ز 20-25. لا تبالغ في تعميق التخدير. لا تقم بتعيين جهاز التنفس الصناعي لتطبيق ضغط نهاية الزفير كما يضعف هذا الإنعاش.
6. باستخدام تقنية معقمة ومجهرا التشغيل ، ووضع ما قبل مسح PE - 10 قسطرة في الوريد الوداجي. ويمكن استخدام أي من الجانبين ، ولكن استخدام الجانب الأقرب إلى المشغل يقلل من فرصة الخلع القسطرة خلال الضغط على الصدر أو معالجات أخرى. 0.5 ٪ bupivicaine ، هو infitrated 0.1 ملم في حواف الجرح للسيطرة على الألم بعد العملية الجراحية.
7. تأمين PE - 10 قسطرة في إقفال الجلد بمادة لاصقة cyanoacrylate الجراحية.
8. مكان تحت الجلد وتوصيل الأقطاب الكهربائية EKG لجهاز الرصد. الاهتمام الدقيق لمسار الإشارات وتعظيم الإشارة نفسها أمر بالغ الأهمية لنجاح الانعاش. ضمان أن يتم تأمين جميع الأسلاك إلى السطح التشغيل ، وتقليل المعابر إشارة ، والتقليل من المواد العازلة (مثل الهواء في الإبر جوفاء أو أسلاك الذين تقطعت بهم السبل) ضمن مسار الإشارات. ويمكن شراء إبر الصلبة متصلة الأسلاك يؤدي nonstranded أو مصنوعة في المختبر. مرة واحدة متصلة ، وتحسين EKG إشارة على الشاشة.

2. توقف القلب

1. تأكد من أن الماوس normothermic ، على النحو المحدد في درجة الحرارة 36.5 درجة مئوية المستقيم -- 37.5 درجة مئوية. تدير 40 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة 0.5 كلوريد البوتاسيوم عن طريق الوريد ومراقبة M كهرساوي التتبع على رسم القلب. تعديل الجرعة لوزن ليس من الضروري في نطاق 20-25 غرام بدء الموقت الاعتقال.
2. لفصل جهاز التنفس الصناعي. وقف بخار مخدر. إيقاف لوحة التدفئة وغيرها من المعدات التي تنتج الضوضاء الإلكترونية التي قد تتداخل مع مراقبة تخطيط القلب. مكان غطاء عازل على الماوس.
3. حرارة قياسية في كل دقيقة أثناء السكتة القلبية. إذا لزم الأمر ، يمكن استخدام مصباح التدفئة لتحقيق درجة الحرارة الأساسية تصل إلى نطاق normothermic. أثناء السكتة القلبية ، وإعداد المستلزمات والمعدات (على سبيل المثال ، حقنة أدرينالين) للإنعاش. ويمكن للقائمة أن تكون مفيدة لضمان الإنعاش دون انقطاع ، وهو أمر ضروري من أجل البقاء.
4. بعد 7 دقائق و 30 ثانية من توقف القلب ، وإعادة التنفس وزيادة معدل التنفس إلى 180 / دقيقة ، والحفاظ على حجم المد والجزر في الإعداد قبل القبض عليه.
5. في 8 دقائق ، والشروع في الضغط على الصدر في 300 BPM. يمكن استخدام الأداة الحركة على رسم القلب لمعدل CPR القاضي. وينبغي تسليم الضغط على الصدر مع السبابة ، 5 مم فوق عملية الخنجري وقليلا الى اليسار من خط الوسط. يجب ضغط الصدر 1/3-1/2 من المسافة الأمامي الخلفي ويجب أن يسمح الارتداد الكامل بين الاختزالات. وضع الاصبع والضغط ضغط الأمثل هي في غاية الأهمية. الفشل في تحقيق البقاء في هذا النموذج هو دائما تقريبا بسبب CPR الأمثل.
6. ضخ 0.5 مل من الادرينالين ، مخففة إلى 15 ميكروغرام / مل ، في الثواني ال 30 الأولى من البطاقة السكانية. مجموع جرعة أدرينالين هو 8-12 ميكروغرام. مراقبة بعناية EKG لعودة تداول العفوية (المفترضة). وتعتبر ضيقة المعقدة بين المجمعات QRS ضغط التحف. ROSC يحدث عادة بين 90 ثانية و 2 دقائق بعد بدء تشغيل البطاقة السكانية. إذا تم التخلي عن الإنعاش ROSC لا يحدث قبل 3 دقائق. ولوحظت كثرة تقلصات البطين سابقا لأوانه ، والتغيرات في محور EKG في الدقائق الأولى بعد ROSC 2 ، ودائما تقريبا إلى حل تسرع الجيوب ثابتة عند 2 دقيقة.
7. سجل إجمالي الوقت للإنعاش وجرعة أدرينالين. حرارة قياسية في كل دقيقة لمدة 10 دقيقة بعد المفترضة.
8. يمكن إزالتها يؤدي EKG عندما يبدأ التنفس العفوي ، وعادة في غضون 12-15 دقيقة بعد المفترضة.
9. ينزع الأنبوب في القصبة الهوائية عند معدل التنفس العفوي هو> 60/min.
10. ضع الماوس في قفص الانتعاش درجة الحرارة على سطح تسيطر مجموعة إلى 37 درجة مئوية لمدة ساعة وpostprocedure first 2 ، وضمان سهولة الوصول إلى الغذاء والماء. قد يكون القفص ثم انتقلت إلى مستوى ظروف السكن بعد الجراحة عندما الماوس تعافى تماما من التخدير ونشطة.

3. استنزاف / الإرواء التثبيت ، والحصاد الكلى

1. 24H بعد CA / CPR ، وتحدث مع التخدير 3-4 ٪ isoflurane وتأمين الحيوانات في موقف ضعيف على سطح الجراحية داخل غطاء الدخان الذي هو مناسبة للاستخدام مع الفورمالين..
2. تعميق التخدير تدريجيا عن طريق زيادة تركيز بخار مخدر إلى 5 ٪ وضمان الفأر هو تخدير عميق كما يتضح من وقف التنفس التلقائي.
3. أداء بضع الصدر صدفي ويستنزف الماوس عبر ثقب قمية من البطين الأيسر في القلب وفقا للتقنيات القياسية.
4. عبر الإبرة نفسها ، وإدارة المياه المالحة 0.9 ٪ بالتسريب البطيء. لنضح acclerate / استنزاف ، نيك أطرافهم الحق الأذيني مع المقص. تنفيذ ومراقبة البطن الكليتين. عندما يتم متبيض انهم قد يتم تغيير المياه المالحة الى 4 ٪ عن الفورمالين التثبيت. هي جزء لا يتجزأ ثم الكلى في البارافين وملطخة الفلورية اليشم B للالكمي للنخر أنبوبي الظهارية.

4. ممثل النتائج :

عندما يتم بفعل CA ، يعني الضغط الشرياني (MAP) والإقليمية تدفق الدم كلوي (RRBCF) تنخفض إلى الصفر تقريبا ، وتظل مستقرة حتى يبدأ الإنعاش (الشكل 1). 24H بعد مرتفعة بشكل ملحوظ CA / CPR ، ومؤشرات وظائف الكلى مصل (الدم واليوريا والنيتروجين ، والكرياتينين BUN) نسبة إلى الشام التي تديرها الحيوانات. AST / ALT هي أيضا مرتفعة ، وتقدم دليلا على نقص التروية كامل الجسم عميقة (الشكل 2). العدلة - جيلاتيناز المرتبطة lipocalin (NGAL) ، وهو مؤشر حساس للإصابة نقص تروية الكلى على نطاق واسع بعد 24H upregulated CA / CPR (الشكل 3). أخيرا ، photomicrographs شرح غير مكتمل ، نخر النخاعية نموذجية من الإصابة الكلوية الدماغية مع ترقق الظهارة الأنبوبية وملء اللمعية على الهيماتوكسيلين وصمة عار يوزين (الشكل رقم 4 ، لوحة أ) واسعة النطاق في موت الخلايا النخاعية الظهارة الأنبوبية عند ملطخة الفلورية اليشم B ( الشكل 4 ، لوحة ب).

يمثل الشكل 1. السكتة القلبية يدفع خسارة فورية للضغط التروية ، وهنا كما يعني الضغط الشرياني (MAP) يقاس في شريان الفخذ ، مما أدى إلى توقف شبه الكامل من المنطقة القشرية الكلوي تدفق الدم (RRCBF) طوال فترة توقف القلب (مظللة المنطقة). الإنعاش مع الضغط على الصدر وترجع إلى وضعها الطبيعي خريطة الإيبينيفرين وRRCBF باضطراد في فترة ما بعد الإنعاش. أعيد طبعها بإذن من ^14.

الشكل 2. 24H postprocedure والدم واليوريا والنيتروجين (بون) ، مصل الكرياتينين ، ومدى موت الخلايا أنبوبي كلها مرتفعة بشكل ملحوظ في الحيوانات بعد أن خضع CA / CPR بالمقارنة مع الحيوانات تعامل مع إجراء صورية. CA / CPR يدفع إهانة لعموم العضوي الدماغية ، والدليل هنا من قبل الارتفاع الهائل للانزيمات الكبد وظيفة الأمينية ترانسفيراز الألانين (ALT) واسبارتاتي ناقلة الأمين (AST) في CA / CPR بالمقارنة مع الفئران المعالجة الصورية الحيوانات.

الشكل 3. يؤديها لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة لالعدلة جيلاتيناز النسائل المتعددة المرتبطة lipocalin (NGAL) ، وهو مؤشر حساس للإصابة نقص تروية الكلى. وتم الحصول على عينات من البول مباشرة قبل ("قبل") وبعد 24H ("24H") CA / 4 CPR في الحيوانات (المسمى أ ، ب ، ج ، د ، وأعلاه). وعلى نطاق واسع upregulated NGAL في الماوسالبول بعد CA / CPR. أعيد طبعها بإذن من ^14.

الشكل 4 ألف) الهيماتوكسيلين يوزين وصمة عار لمقطع قصير من محور نقيري 24H النسيج الكلوي بعد CA / CPR. هناك ضرر غير مكتمل ولكنه واضح لنبيبات النخاعية وcorticomedullary مع توصيل أنبوبي. الأسهم تشير إلى تلف الأنابيب مع النوى ، وتورم تغلظي عند تقاطع corticomedullary. B) Flouro - B اليشم وصمة عار في نفس المنطقة في نفس الحيوان ، 24H بعد CA / CPR. B - البقع الفلوري اليشم نخرية الخلايا الخضراء الزاهية ، والتي تبين مكتمل نخر أنبوبي corticomedullary. الأسهم تشير إلى تلف الأنابيب الملون بألوان زاهية في مفترق corticomedullary. هذه النتائج مشابهة لنتائج كبيرة خزعة الكلى من البشر الذين يصابون AKI ، وخلافا لتلك التي تنتجها النماذج الحيوانية الأخرى AKI

Discussion

نموذج normothermic من السكتة القلبية والإنعاش القلبي في الماوس تقدم سبلا متعددة من التقييم في النموذج الذي يعيد الفيزيولوجيا المرضية ومورفولوجية يسبب السريرية الأكثر شيوعا لآكي ، كامل الجسم نقص انسياب الدم. ويمكن اختبار الفرضية التي ساعدت على الوصول إلى مجموعة كاملة من تقنيات التلاعب الجيني ، وعلم التشريح غير مفهومة بشكل جيد ، وتميزت وعلم وظائف الأعضاء للفأرة المختبر.

كما هو موضح هنا ، والبقاء على قيد الحياة في أيدي ذوي الخبرة هو 80 ٪. على الرغم من أن إعداد الجراحية والرعاية في مرحلة ما بعد الاعتقال هي واضحة ، وإنعاش الفعلي للماوس اعتقل هو المهارة الجراحية التي تحديا كبيرا يتطلب ممارسة. في تجربتنا ، resuscitations ناجحة تصبح القاعدة بعد حوالي 30-50 المحاولات الأولى في إحياء الحيوانات الفردية من قبل جراح قليل الخبرة ، والإصابات متسقة والإنعاش اتخاذ الممارسة إضافية. على وجه الخصوص ، خلال المرحلة المبكرة من تعلم تقنية (أي للحيوانات ال 20 الاولى) ، من غير المرجح بقاء ذات مغزى ، ويجب أن يتم التخلص على الفور أي ناجين بعد الإنعاش لمنع الاستغاثة لا لزوم لها. بعد التدريب في وقت مبكر ، عندما تبين الناجين انتعاش قوي القلب في الدقائق التالية الإنعاش ، فمن المناسب أن يستمر على قيد الحياة الحيوانات من خلال العلامة ROSC بعد 15 دقيقة. والحيوانات التي لشرح جهود حثيثة من قبل الجهاز التنفسي عفوية تلك النقطة البقاء على قيد الحياة على الأرجح 24H مع الانتعاش المناسبة. وينبغي ممارسة هذه المرحلة موجهة تحديدا في بروتوكولات IACUC. المهارة الأكثر صعوبة في التعلم هو الضغط على الصدر نفسها فمن الصعب تقديم الاختزالات بمعدل اللازمة دون زيادة الضغط على المستويات الضارة. وقد وضعت resuscitators الميكانيكية واستخدامها في المختبر و ¹⁶ اخرين ولكن حتى الآن لا يوجد جهاز تنفس ميكانيكية لالفأر أنتجت بقاء مقبولة.

هناك بعض القيود على هذا الطراز. أولا ، لا يمكن لنموذج الفأر نموذجا كاملا الفسيولوجيا البشرية ، ويجب أن تفسر النتائج مع احترام الاختلافات بين الأنواع. على وجه الخصوص ، في قلب فأر قوي ؛ نحقق بقاء 80 ٪ في 8 دقائق من توقف القلب ، ولكن في الدراسات السريرية بقاء الجنس البشري هو أقل من 50 ٪ حتى مع بداية الإنعاش 2-3 دقائق بعد اعتقال ¹⁷ من صغر حجم الماوس. الإجراءات الصارمة يجعل من الناحية الفنية ، وهناك منحنى التعلم كبيرة ، لا سيما بالنسبة الضغط على الصدر. الثانية ، في هذا البروتوكول ، فلن تتم فهرسة جرعات المخدرات وضبط التنفس الصناعي لوزن الحيوان. هذا هو لأننا فقط استخدام الحيوانات في نطاق 20-25 غرام في الوزن لتقليل تأثير حجم المعدات. على سبيل المثال ، فإننا نستخدم قسطرة قياس 22 إلى intubate القصبة الهوائية ، والحصول على ختم ليست هي نفسها في 30 غ الماوس كما هو الحال في ماوس ز (25) وزيادة تسرب الغاز قد تكون هامة من الناحية الفسيولوجية. ومع ذلك ، فإن استخدام الحيوانات في مجموعة محددة الوزن لا بأمانة إنتاج مجموعة متنوعة من الطبقات الجسم التي تخضع للإصابة نقص التروية ، ضخه السريرية. ثالثا ، يمكن للدولة بعدم تكرار تدفق بأمانة لا نتائج من الدول منخفضة التدفق. على وجه الخصوص ، قد وضع ضمن تدرجات حرارة الماوس خلال أي تدفق. للحد من تأثير (إن وجدت) من التدرجات على النتائج ، ويتم قياس درجة حرارة بالقرب من جهاز من الفائدة. أخيرا ، وذلك لأن البيانات في وقت مبكر من مختبرنا الذي أكد الحماض الأيضي كبير في postarrest الفترة ، ونحن hyperventilate خلال الإنعاش. والبيانات الأخيرة تشير إلى أن سرعة التنفس خلال CPR هو ضار ، ^18،19 فمن الممكن أن يقلل من بقاء هذه الممارسة في النموذج. العديد من البدائل نماذج لكامل الجسم الاصابة ضخه الإسكيمية موجود. على سبيل المثال ، فقد وصفت CA / CPR في الكلاب ، ²⁰ الأرانب والحملان ²¹ ، ²² الخنازير والفئران ²³ و ¹⁶ و السناجب البرية في القطب الشمالي ^(24).

وقد أظهرت لنا أن يمكن تقييم وظيفة الكلى بعد العملية الجراحية من قبل عدد من المواد الكيميائية ، المناعية ، أو التقنيات النسيجية في 24 ساعة. يمكن أن يكون نجا من الحيوانات لمدة أطول من 24H ، ومع ذلك ، وطبيعة عابرة للآكي يجعل هذا النموذج جذاب واحد لاستخدامه في التحقيق في آليات استرداد و / أو إصابة دائمة. الإصابة نفسها المعايرة عن طريق تغيير المعلمات من الوقت ودرجة الحرارة خلال CA. يعد اعتقال والصيانة عن ارتفاع درجات الحرارة تنتج أكبر ضرر (ولكن بقاء سلبا المفعول). كما بينا مع البيانات وظائف الكبد وشملت ، كما تتأثر أجهزة الجسم الأخرى ، وربما يتم التحقيق به التعديلات من هذا النموذج ، ومع ذلك ، قد يكون مطلوبا بذل جهد كبير لتحسين ظروف تجريبية لنظام الجهاز من الفائدة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium Chloride	Abbott Laboratories	06653-5
Isoflurane	Abbott Laboratories	05260-05 (and others)
Epinephrine HCl	Multiple Suppliers	Multiple
Digi-Sense temperature controller	Cole-Parmer	EW-89000-00
Angiocath IV Cath	VWR international	381134
Frova angled airway introducer	Cook	G27282
MicroVent Ventilator for Mice	Harvard Apparatus	733591