Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen in neurale Vorläuferzellen

Zusammenfassung

Quelle: Phillips, A. W., et al. Entwicklung von HiPSC-abgeleiteten serumfreien Embryoidkörpern für die Abfrage von 3-D-Stammzellkulturen unter Verwendung physiologisch relevanter Assays. J. Vis. Exp. (2017).

Das Video demonstriert eine Technik zur Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) in neurale Vorläuferzellen (NPCs). Zunächst werden die hiPSCs auf einer Feeder-Schicht aus embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus kultiviert. Anschließend werden die Zellen abgetrennt und auf eine mit Biopolymer beschichtete Platte übertragen, damit die MEFs an den hiPSCs haften und sich von ihnen trennen können. Die suspendierten hiPSCs werden dann auf eine V-Bodenplatte überführt und zu Aggregaten zentrifugiert. Schließlich induziert die Zugabe eines Differenzierungsmediums die Differenzierung von hiPSCs innerhalb des Aggregats in NPCs.

Protokoll

>1. Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen

1. Halten Sie hiPSCs, die aus Fibroblasten und mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) gewonnen wurden, in 6-Well-Platten auf einer γ-bestrahlten embryonalen Maus-Feeder-Zellschicht (MEF) in humanem iPSC-Medium, das mit kleinen Molekülen ergänzt wurde.
   HINWEIS: Bei der täglichen Wartung handelt es sich um eine modifizierte Version der zuvor gemeldeten Verfahren.
   1. Platte 6 x 10⁵ MEFs auf jede Vertiefung einer 6-Well-Platte in Gewebekulturqualität in 300 μl/Well empfohlenem Medium (gemäß dem Protokoll des Herstellers).
   2. Ersetzen Sie nach 48 h das MEF-Medium 1 h lang durch 300 μl/Well-hiPSC-Medium, bevor Sie hiPSCs hinzufügen.
   3. Tauen Sie die hiPS-Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad schnell auf und fügen Sie langsam tropfenweise 1 mL hiPS-Medium hinzu. Übertragen Sie die hiPS-Zellen und das Medium in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Fügen Sie Medium hinzu, um das Gesamtvolumen auf 5 ml zu bringen. 4 min bei 129 x g zentrifugieren, den Überstand aspirieren, das Pellet in 1 mL hiPSC-Medium mit einem Rho-assoziierten Proteinkinase (ROCK)-Inhibitor in einer Konzentration von 1:1.000 vorsichtig resuspendieren.
   4. Die Zellsuspension (in der Regel mit 300.000 Zellen/Vertiefung ausgesät) auf die MEF-Zellschicht aufbringen und bei 37 °C, 5 % CO_{2 und} 95 % Luftfeuchtigkeit inkubieren.
   5. Überwachen Sie die iPSC-Kultur genau mit einem Lichtmikroskop. Nach 48 h werden Kulturen entnommen, die unebene Ränder haben, zystisch geworden sind oder unter dem Lichtmikroskop gelblich-braun erscheinen, um die spontane Differenzierung zu minimieren.
      Anmerkung: Nach 7 - 10 Tagen sollten sich hiPS-Kolonien bilden. Die Kolonien sollten rund sein, mit klar definierten Grenzen und gleichmäßigen Zelldichten und frei von locker gepackten, ungleichmäßigen Zellen.
   6. Manuelle Auswahl runder hiPSC-Kolonien, um die Kultur von spontan differenzierten Zellen zu befreien. Erweitern Sie die Kolonien, indem Sie sie auf frischen MEF-Schichten platzieren. Expandieren Sie alle 7 Tage um 1:3, wenn sich Kulturen dem Zusammenfluss nähern und einfrieren.
2. Nach der Expansion und dem Einfrieren der Zellen (als Backup) züchten Sie hiPSC-Kolonien auf Platten, bis sie eine Konfluenz von 50 - 75 % erreichen.
3. Sieben Tage nach der Beschichtung verwenden Sie eine milde enzymatische Behandlung (5-10 Minuten mit 300 μl Enzymlösung) und eine sanfte Verreibung (2-4 Mal mit einer 1.000-μl-Pipette), um hiPSCs zu ernten und für die Differenzierung neuraler Vorläuferzellen vorzubereiten.
4. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 129 x g für 4 Minuten, aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 5 mL humanem iPSC-Medium. Übertragen Sie die Zellsuspension für 1 h bei 37 °C in eine mit 0,1 % Gelatine beschichtete 5-cm-Zellkulturschale, um MEFs zu eliminieren und die hiPSC-Ausbeute zu maximieren. Übertragen Sie das Medium (mit nicht anhaftenden Zellen) in eine andere 5 cm mit Gelatine überzogene Schale.
5. Übertragen Sie die nicht adhärenten Zellen mit einer Transferpipette in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie die Platten vorsichtig mit 3 mL Medium aus und geben Sie es in das 15 mL Röhrchen.
6. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 129 x g für 4 min, saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in Medium. Bestimmen Sie die Zellzahl mit einem automatisierten Zellzähler. Platte 9.000 Zellen/Well in einer 96-Well-Platte mit geringer Adhäsion mit V-Boden.
7. Die Platte bei 163 x g 3 min zentrifugieren. Die Platte bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO₂ inkubieren. Wechseln Sie mit einer Pipette jeden zweiten Tag 50 % des Mediums, indem Sie die Hälfte des Mediums entfernen und es durch frisches, chemisch definiertes Differenzierungsmedium 1 (DM1; Abbildung 1; Tabelle der Materialien) für 14 Tage.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung der ersten Schritte bei der Vorbereitung von SFEBs. Nachdem iPS-Zellen mittels enzymatischer Dissoziation geerntet wurden, werden sie in 96-Well-Platten plattiert und 3 Minuten lang bei 163 x g zentrifugiert, um eine schnelle Aggregation zu induzieren. Nach 14 Tagen in vitro (DIV) können Zellaggregate von 96-Well-Platten über Pipetten mit breiter Bohrung auf 6...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
SFEB Zellkulturmedien zur neuronalen Differenzierung. Reagenzien. Komponenten
STEMdiff Neuronales Induktionsmedium (hiPSC Media)	STEMCELL-Technologien	0-5835	ca. 250 ml
PluriQ ES-DMEM Medium (MEF-Medien)	GlobalStem	GSM-2001
DM1 Medienkomponenten
D-MEM/F-12 (1X), Glutamax-Flüssigkeit, 1:1	Invitrogen	10565018	385 ml
Knockout-Serum-Ersatz	Invitrogen	10828028	20% 100ml
Stift/Streptokokken	Invitrogen	15140122	5ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5ml
MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren 10 mM (100X), flüssig	Invitrogen	11140050	5ml
2-Mercaptoethanol (1.000X), flüssig	Invitrogen	21985023	900ul
Kleine Moleküle
Y27632 (ROCKi)	Stemgent	Artikel-Nr.: 04-0012-10	10μm
Komponenten/Materialien
Embryonale Fibroblasten der Maus	GlobalStem	GSC-6301G
96 Well V-Boden mit Deckeln	immergrün	222-8031-01V
StemPro Accutase Reagenz zur Zelldissoziation	ThermoFisher	A1110501
6 Brunnen flacher Boden	Falke	353046