Entwicklung und Pflege serumfreier Embryoidkörper

Zusammenfassung

Quelle: Phillips, A. W., et al. Entwicklung von HiPSC-abgeleiteten serumfreien Embryoidkörpern für die Abfrage von 3-D-Stammzellkulturen unter Verwendung physiologisch relevanter Assays. J. vis. exp. (2017).

Das Video beschreibt das Verfahren zur Entwicklung serumfreier Embryoidkörper (SFEBs) aus neuronalen Vorläuferzellen unter Verwendung verschiedener serumfreier Differenzierungsmedien oder DM. DM-2 erleichtert die Reifung und Anordnung von Neuronen zur Bildung von SFEBs, während DM-3 zur weiteren Wachstumserhaltung verwendet wird.

Protokoll

>1. Induktion des serumfreien Embryoidkörpers (SFEB) (Abbildung 1)

1. Platzieren Sie 40 μm Zellkultureinsätze in 6-Well-Platten und fügen Sie mindestens 1 h vor der Zugabe von Aggregaten 1 ml Differenzierungsmedium 1 (DM1) (Materialtabelle) hinzu.
2. Übertragen Sie die neuralen Vorläuferzellaggregate mit 20 μl Medium unter Verwendung einer 200 μl Weithalsspitze auf 40 μm Zellkultureinsätze und wechseln Sie das Medium auf DM2 (Table of Materials).
   Anmerkung: Zellkultureinsätze sind spezielle Einsätze, die leicht über dem Boden der Vertiefung sitzen und aus einer Polytetrafluorethylenmembran bestehen, die über einem Kunststoffrahmen aufgehängt ist. Diese Membran ist biokompatibel und kann den Nährstoff- und Sauerstofftransport zu den darauf platzierten SFEBs effizient aufrechterhalten. Sie werden häufig bei organotypischen Hippocampus-Schnittkulturen verwendet, die von einer Maus oder Ratte entnommen wurden.
   1. Übertragen Sie 4-6 Aggregate auf einen Zellkultureinsatz und lassen Sie ausreichend Platz zwischen den Aggregaten. Entfernen Sie so viel überschüssige Lösung wie möglich mit einer feinen Pipettenspitze (z. B. 200 μl Spitze).
      HINWEIS: Es ist akzeptabel, die SFEBs kurz zu stören, da sie sich auf dem Zellkultureinsatz bewegen, wenn die Lösung aus der Umgebung der SFEBs entfernt wird.
   2. Bewahren Sie die Kulturen in 1 ml DM2 bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 auf. Wechseln Sie mit einer Pipette alle zwei Tage 75 % des Mediums, indem Sie drei Viertel des Mediums entfernen und durch drei Viertel frisches Medium ersetzen. Entfernen Sie z. B. 750 μl Medium und fügen Sie 750 μl frisches Medium hinzu.
3. Wechseln Sie nach 14 Tagen Kultur zu DM3-Medium (Table of Materials) mit 75 % Mediumwechsel jeden zweiten Tag und für weitere 16 Tage.
4. Um die SFEBs auf Zellkultureinsätzen länger als 30 Tage zu erhalten, wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag für 60, 90 und 120 Tage.
   Anmerkung: Die SFEBs erreichen einen Durchmesser von etwa 1.000 μm und sind in der Regel 100-150 μm dick.
5. Lösen Sie die SFEBs vom Einsatz, indem Sie das Medium vorsichtig mit einer 200-μl-Weithalspipettenspitze pipettieren. Um die SFEBs zu übertragen, verwenden Sie eine Weithalspipettenspitze, um die Körper vorsichtig in die Pipettenspitze zu saugen. Nach dem Laden von SFEB in die Pipettenspitze vorsichtig auf 12-Well-Platten umfüllen und mit 300 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) pro Well waschen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Zeitleiste der Medienwechsel und -phasen während des Wachstums und der Expansion der SFEB.

Nachdem SFEBs auf Inserts übertragen wurden, durchlaufen sie nach 14 und 28 Tagen in vitro (DIV) zwei Mediumwechsel. Sie werden in der Regel für Experimente in den DIV 30, 60 und 90 gesammelt. Obere Einschübe zeigen verschiedene Phasen dieses Proz...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
SFEB Zellkulturmedien zur neuronalen Differenzierung. Reagenzien. Komponenten
STEMdiff Neuronales Induktionsmedium (hiPSC Media)	STEMCELL-Technologien	0-5835	ca. 250 ml
PluriQ ES-DMEM Medium (MEF-Medien)	GlobalStem	GSM-2001
DM1 Medienkomponenten
D-MEM/F-12 (1X), Glutamax-Flüssigkeit, 1:1	Invitrogen	10565018	385 ml
Knockout-Serum-Ersatz	Invitrogen	10828028	20% 100ml
Stift/Streptokokken	Invitrogen	15140122	5ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5ml
MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren 10 mM (100X), flüssig	Invitrogen	11140050	5ml
2-Mercaptoethanol (1.000X), flüssig	Invitrogen	21985023	900ul
DM2 Medienkomponenten
D-MEM/F-12 (1X), Glutamax-Flüssigkeit, 1:1	Invitrogen	10565018	500 ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5ml
Stift/Streptokokken	Invitrogen	15140122	5ml
N-2 Supplement (100X), flüssig	Invitrogen	17502048	10 ml
DM3 Medienkomponenten
NEUROBASALES Medium (1X), flüssig	Invitrogen	21103049	500 ml
B-27 Supplement Minus Vitamin A (50X), flüssig	Invitrogen	12587010	10 ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5ml
Stift/Streptokokken	Invitrogen	15140122	5ml
Komponenten/Materialien
	Millizelle	PICM0RG50
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	ThermoFisher	10010023	500 mL