Konstruktion gemusterter neuronaler Schaltkreise auf einem Mehrelektrodenarray

Zusammenfassung

Quelle: Kanner, S., et al. Design, Oberflächenbehandlung, zelluläre Beschichtung und Kultivierung modularer neuronaler Netzwerke, die aus funktional miteinander verbundenen Schaltkreisen bestehen. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video zeigt den Prozess der Kultivierung neuronaler Zellen auf einem gemusterten Multi-Elektroden-Array (MEA), um modulare neuronale Netzwerke zu etablieren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der neuronalen Signalübertragung und zellulärer Wechselwirkungen.

Protokoll

>1. Vorbereitung eines Multi-Electroden-Arrays (MEA)

1. Reinigen Sie MEA in dieser Reihenfolge (Materialtabelle):
   1. Mit Wasser unter fließendem Wasser waschen und 3 Mal in einem konzentrierten, enzymatischen Reinigungsmittel beschallen.
   2. 3 mal in destilliertem Wasser beschallen.
   3. 3 Mal mit destilliertem Wasser (in der Haube, 1.000 μl Spitze) waschen und 30 Minuten lang unter UV-Strahlung (UV) stellen.
2. Unterstützung der Netzwerkvorbereitung:
   1. Bereiten Sie die entworfene Form des Stütznetzes vor.
      1. Gießen Sie Polydimethylsiloxan (PDMS) in eine 12-Well-Platte (22 mm Durchmesser).
      2. Wenn das PDMS ausgehärtet ist, entfernen Sie die Form und schneiden Sie mit einem Skalpell ein Loch in die Mitte, um eine Ringform zu erhalten.
      3. Platzieren Sie eine entworfene Stütznetzform in der Mitte des MEA (Abbildung 1A) und bedecken Sie den Rest der Oberfläche 2 Stunden lang bei Raumtemperatur (RT) mit Poly-D-Lysin (PDL).
   2. Entfernen Sie PDL mit einer Pipette und waschen Sie es mit destilliertem Wasser.
   3. Entfernen Sie die Form und lassen Sie sie trocknen (Abbildung 1A).
3. Richten Sie die Schablone wie folgt an MEA aus:
   1. Legen Sie die Schablone auf den dafür vorgesehenen Mikromanipulator. Verwenden Sie ein inverses Mikroskop, um die strukturierte Struktur genau an den Elektroden auszurichten, und senken Sie die Schablone ab, bis sie auf der MEA-Oberfläche platziert wird (Abbildung 1B).
      Anmerkung: Der Kontakt mit einem gut gereinigten MEA sorgt für eine wettbewerbsfähige Haftung zwischen dem PDMS und dem MEA selbst.
   2. Heben Sie den Mikromanipulator an und üben Sie bei Bedarf mit einer Pinzette einen kleinen Druck auf das PDMS aus, um zu verhindern, dass es sich vom MEA löst.
   3. Drücken Sie die Schablone vorsichtig auf die MEA-Oberfläche und überprüfen Sie mit einem Mikroskop, ob sie fest befestigt und gut ausgerichtet ist (Abbildung 1C-D).
4. Legen Sie MEA für 15 min in eine Vakuumkammer und geben Sie einen 1 ml Tropfen PDL auf die Schablone.
5. 2 Mal für jeweils 20 min in die Vakuumkammer einführen. Lassen Sie PDL O/N im Inkubator trocknen.
6. Entfernen Sie vor dem Plattieren die PDMS-Schablonen von MEAs und waschen Sie sie mit sterilem Wasser. 7 Min. unter UV-Beleuchtung stellen.

>2. Plattieren

1. Berechnen Sie die Anzahl der Zellen, die für die Beschichtung benötigt werden, mit einem Hämozytometer
   1. Vergewissern Sie sich, dass die Zählkammer (Hämozytometer) sauber ist, und legen Sie ein Deckglas darauf (Verwenden Sie zum Reinigen Alkohol).
   2. 10 μl der Zellsuspension in 190 μl Plattierungsmedium verdünnen (Verdünnung 1:20).
   3. Laden Sie 10 μl der verdünnten Zellen auf den Rand der Zählkammer und pipettieren Sie die Zellen langsam heraus, so dass sich die Kammer selbst füllen kann.
   4. Visualisieren Sie mit einem inversen Mikroskop das Hämozytometergitter. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen in der Kammer durch direkte Zählung (gesunde Zellen sollten rund sein). Zählen Sie die Zellen innerhalb des großen Quadrats, ohne dass diese die Ränder kreuzen.
   5. Berechnen Sie die Konzentration der Zellen:
      Gesamtzahl der Zellen/1000 μl = Gesamtzahl der × Verdünnungsfaktor gezählten Zellen × 10⁴ (Fläche des Hämozytometers).
      Anmerkung: Wenn der Verdünnungsfaktor beispielsweise 20 beträgt und die Gesamtzahl der gezählten Zellen 100:
      100 × 20 × 10⁴ = 0,1 x 10⁷ Zellen/1.000 μl oder 1 x 10⁶/100 μl. Um 0,75 x 10⁶ Zellen zu plättieren, werden 75 μl aus den Zellen entnommen.
2. Nehmen Sie die Anzahl der Zellen, die für die Beschichtung pro einzelner MEA- oder Petrischale benötigt werden, resuspendieren Sie die Zellen, um eine Aggregation zu verhindern, und plattieren Sie sie in der Mitte, auf dem gemusterten Bereich (die Zellen können bei Bedarf im Medium verdünnt werden). Für die MEA geben Sie einen 100 μl Tropfen in die Mitte. Für das Deckglas geben Sie einen 1.000 μl Tropfen in die Mitte.
3. Die plattierten Zellen werden 40 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Den plattierten Zellen wird bis zu 1 ml pro MEA und 2 ml pro Deckglas mit Plattierungsmedium zugesetzt.
4. Bei 37 °C aufbewahren und alle 4 Tage mit frischem Wachstumsmedium verdünnen, das mit 0,5 Pen-Strep, 2 % B-27 und 0,75 % Glutamax angereichert ist.
5. Ab 6/7 DIV verdünnen Sie das Medium, nachdem Sie Verbindungen zwischen den Inseln gesehen haben, mit 10 μl/ml FUDR (25 mg Desoxyuridin + 62,5 mg Uridin in 12,5 ml MEM (Minimum Essential Medium Eagle)) oder einem anderen antimitotischen Mittel, um eine Überwucherung der Gliazellen zu verhindern.

Ergebnisse

Abbildung 1. PDMS-Strukturablagerung auf einer MEA. (A) PDMS-Form mit einer Ringform (gekennzeichnet mit dem roten Pfeil), die auf einem MEA montiert ist. Die Form wird verwendet, um den Bereich zu beschichten, der für das unterstützende neuronale Netzwerk bestimmt ist und sich an der Peripherie des Kultivierungsbereichs befindet (dies wird durch den auf dem MEA montierten Ring begrenzt, der du...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
PDMS, Sylgard 184	Dow Corning
Nalgene Vakuumkammer	Thermo	Artikel-Nr.: 5305-0609
Poly-D-Lysin PDL	Sigma	Nr. 7886
12-Well-Kulturplatte	Sigma	CLS3336
5-Fluor-2'-Desoxyuridin	Sigma	Nr. F0503
MEA1060-Inv-BC	Mehrkanal-Systeme
TC02	Mehrkanal-Systeme
Pen Strep	Biologische Industrie Beit Haemek	03-033-1c
B-27	Gibco	17504044
glutaMAX	Gibco	Artikel-Nr.: 35050-038
MEM Minimum Essential Medium-Eagle	Biologische Industrie Beit Haemek	01-025-1B
Mikro-Elektroden-Arrays 4Q	Mehrkanal-Systeme	60-4QMEA1000iR-Ti-pr	Reinigungsanleitung: http://www.multichannelsystems.com