Differenzierung von künstlich hergestellten humanen induzierten pluripotenten Stammzellen in funktionelle Motoneuronen

Abstract

Quelle: Garone, M. G., et al. Umwandlung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) in funktionelle spinale und kraniale Motoneuronen unter Verwendung von PiggyBac-Vektoren. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video zeigt den Prozess der Differenzierung menschlicher iPSCs in Motoneuronen. Die Begründung beinhaltet die Verwendung von iPSCs, die genetisch verändert wurden, um bestimmte Transkriptionsfaktoren zu exprimieren. Wenn dieses Antibiotikum in einem Medium kultiviert wird, das Doxycyclin enthält, löst es die Expression von Transkriptionsfaktoren aus und fördert dadurch die Differenzierung von iPSCs in Motoneuronen-Vorläuferzellen. Letztendlich werden die Vorläuferzellen in einem neuronalen Medium kultiviert, um reife und funktionsfähige Motoneuronen zu erhalten.

Protocol

>1. Pflege humaner iPSCs

1. Vorbereitung von matrixbeschichteten Platten
   1. Tauen Sie ein 5-ml-Fläschchen mit Matrix (siehe Materialtabelle) über Nacht bei 4 °C auf. Die ursprünglichen Matrixbestände liegen in unterschiedlichen Stammkonzentrationen vor, und die Aliquote werden gemäß dem auf dem Datenblatt angegebenen Verdünnungsfaktor hergestellt und sind spezifisch für die jeweilige Charge. Es ist wichtig, das Fläschchen und die Röhrchen eiskalt zu halten, um ein vorzeitiges Gelieren der Matrix zu verhindern. Dosieren Sie die Matrix in Aliquoten in vorgekühlten Kryoröhrchen auf Eis. Nicht verwendete Aliquote bei -20 °C einfrieren.
   2. Legen Sie ein Aliquot zum Auftauen ca. 2 h auf Eis.
   3. Das Aliquot der Matrix wird mit 20 mL kaltem DMEM/F12 in einem konischen 50-ml-Röhrchen verdünnt.
   4. Gut mischen und 1 ml verdünnte Matrix in 35-mm-Schalen geben (entsprechende Mengen pro Oberfläche anderer Schalen).
   5. Bewahren Sie die Schalen mit verdünnter Matrix 1 h bei Raumtemperatur auf, damit sie beschichtet werden können.
      Anmerkung: Das mit Parafilm versiegelte Geschirr kann bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
2. Herstellung der Stammlösung (20 mL) und 1x Arbeitsaliquoten des sanften Zelldissoziationsreagenzes (siehe Materialtabelle).
   1. Pulver auf 10 mg/ml in PBS auflösen (Ca²⁺/Mg²⁺ frei)
   2. Der Filter sterilisiert durch eine 0,22 μm Filtermembran.
   3. Bereiten Sie 20 Aliquots (je 1 ml) vor und lagern Sie sie bei -20 °C.
   4. Vor Gebrauch ein Aliquot in PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ frei) auf 1 mg/ml (1x Arbeitsaliquote) verdünnen.
      HINWEIS: 1x Arbeitsaliquote können 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
3. Vorübergehendes Passieren menschlicher iPSCs.
   1. Vor dem Start: Bei Lagerung bei 4 °C matrixbeschichtete Platten im Inkubator bei 37 °C für 20-30 min vorwärmen. Bei Raumtemperatur die benötigte Menge an humanem iPSC-Medium (siehe Materialtabelle) vorwärmen. Den DMEM/F12 vorwärmen.
   2. Nährmedium aspirieren.
   3. Spülen Sie iPSCs mit PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ frei).
   4. Fügen Sie 1x sanfte Dissoziationslösung hinzu (0,5 mL für eine 35-mm-Schale). Inkubieren Sie bei 37 °C, bis sich die Ränder der Bienenvölker von der Platte zu lösen beginnen, normalerweise 3-5 Minuten.
   5. Aspirieren Sie die sanfte Dissoziationslösung und achten Sie darauf, keine iPS-Kolonien abzulösen.
   6. Waschen Sie die Zellen mit DMEM/F12 (2 mL für eine 35-mm-Schale) und aspirieren Sie, wobei Sie darauf achten, dass sich die Zellen nicht ablösen. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
   7. Geben Sie humanes iPSC-Medium hinzu (1 mL für eine 35-mm-Schale).
   8. Lösen Sie die Kolonien vorsichtig mit einem Zellheber ab und überführen Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen.
   9. Brechen Sie Zellklumpen vorsichtig auf, indem Sie mit einer P1000-Pipettierer 3-4 Mal auf und ab pipettieren.
   10. Der Überstand wird aus der matrixbeschichteten Platte(n) abgesaugt.
   11. Die Zellen werden in das entsprechende Kulturvolumen des humanen iPSC-Mediums ausgesät. Das Split-Verhältnis kann von Zeile zu Zeile variieren und liegt bei etwa 1:4-1:8. Wechseln Sie das Medium täglich.

>2. Erzeugung von NIL- und NIP-induzierbaren iPSC-Leitungen

1. Zelltransfektion
   1. Spülen Sie die Zellen mit PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ frei).
   2. Geben Sie das Zelldissoziationsreagenz (siehe Materialtabelle) hinzu (0,35 mL für eine 35-mm-Schale) und inkubieren Sie bei 37 °C, bis die einzelnen Zellen getrennt sind (5-10 min).
   3. Schließen Sie die Zelltrennung sanft ab, indem Sie mit einer P1000-Pipettierer 3-4 Mal auf und ab pipettieren.
   4. In einem 15-ml-Röhrchen auffangen und PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ frei) zu 10 mL hinzufügen. Zählen Sie die Zellen.
   5. 10⁶ Zellen pelletieren und in 100 μl Puffer R resuspendieren (im Zellelektroporationskit enthalten; siehe Materialtabelle).
   6. Fügen Sie Plasmid-DNA für die Transfektion hinzu: 4,5 μg transponierbarer Vektor (epB-Bsd-TT-NIL oder epB-Bsd-TT-NIP12) und 0,5 μg des piggyBac-Transposase-Plasmids.
   7. Transfizieren Sie mit dem Zellelektroporationssystem (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers und wie zuvor beschrieben mit folgenden Parametern: 1.200 V Spannung, 30 ms Breite, 1 Impuls. Die Zellen werden in einem humanen iPSC-Medium, das mit 10 μM Y-27632 (ROCK-Inhibitor, siehe Materialtabelle) ergänzt wurde, in einer 6 mm matrixbeschichteten Schale ausgesät.
2. Selektion mit Antibiotika
   1. Zwei Tage nach der Transfektion geben Sie 5 μg/ml Blasticidin in das Kulturmedium.
   2. Die meisten nicht transfizierten Zellen sterben innerhalb von 48 Stunden nach der Blasticidinauswahl ab. Bewahren Sie die Zellen mindestens 7-10 Tage lang in Blasticidin auf, um die Zellen zu selektieren, die die Transgene nicht in das Genom integriert haben.
   3. Stabil transfizierte Zellen als gemischte Population erhalten, die aus Zellen mit unterschiedlicher Anzahl von Transgenen und unterschiedlichen Integrationsstellen besteht, oder einzelne Klone isolieren.
   4. Bereiten Sie eine zusätzliche Schale vor, um die effektive Expression der Transgene bei 1 μg/ml Doxycyclin-Induktion durch RT-PCR mit transgenspezifischen Primern für Ngn2 zu überprüfen (Vorwärts: TATGCACCTCACCTCCCCATAG; Rückseite: GAAGGGAGGAGGGCTCGACT).
   5. In diesem Stadium werden die Bestände der neuartigen NIL- und NIP-iPS-Linien in einem Gefriermedium für humane iPS-Zellen eingefroren (siehe Materialtabelle).

>3. Differenzierung von Motoneuronen

1. Dissoziieren Sie die Zellen mit dem Zelldissoziationsreagenz wie beschrieben (Schritte 2.1.1.-2.1.3.). Sammeln Sie dissoziierte Zellen in einem 15-ml-Röhrchen und verdünnen Sie sie mit 5 Volumina DMEM/F12. Pelletieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie in einem humanen iPSC-Medium, das mit einem 10 μM ROCK-Inhibitor ergänzt ist. Zählen Sie die Zellen und den Keim auf matrixbeschichteten Schalen mit einer Dichte von 62.500 Zellen/cm².
2. Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag durch DMEM/F12, ergänzt mit 1x stabilem L-Glutamin-Analogon, 1x nicht-essentieller Aminosäure (NEAA) Zellkulturzusatz und 0,5x Penicillin/Streptomycin, enthalten 1 μg/ml Doxycyclin. Dies wird als Tag 0 der Differenzierung betrachtet. An Tag 1 das Medium und Doxycyclin auffrischen.
3. An Tag 2 wechseln Sie das Medium auf Neurobasal/B27-Medium (Neurobasalmedium ergänzt mit 1x B27, 1x stabilem L-Glutamin-Analogon, 1x NEAA und 0,5x Penicillin/Streptomycin), das 5 μM DAPT, 4 μM SU5402 und 1 μg/ml Doxycyclin enthält (siehe Materialtabelle). Frischen Sie das Medium und Doxycyclin täglich bis zum 5. Tag auf.
4. Tag 5: Dissoziation der Zellen mit dem Reagenz der Zelldissoziation (siehe Materialtabelle).
   1. Spülen Sie die Zellen mit PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ frei).
   2. Das Zelldissoziationsreagenz (0,35 mL für eine 35-mm-Schale) zugeben und bei 37 °C inkubieren, bis sich die gesamte Zellmonoschicht von der Schale trennt.
      Beachten Sie, dass einzelne Zellen während der Inkubation nicht getrennt werden.
   3. Fügen Sie 1 mL DMEM/F12 hinzu und sammeln Sie die Zellen in einem 15 mL Röhrchen.
   4. Schließen Sie die Zelltrennung sanft ab, indem Sie mit einer P1000-Pipette 10-15 Mal auf und ab pipettieren.
   5. Fügen Sie 4 ml DMEM/F12 hinzu und zählen Sie die Zellen.
   6. In diesem Stadium frieren Sie die Vorläuferzellen der Motoneuronen in einem Zellgefriermedium ein (siehe Materialtabelle), gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   7. Pelletieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie in neuronalem Medium (Neurobasal/B27-Medium, ergänzt mit 20 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF und 200 ng/mL L-Ascorbinsäure, siehe Materialtabelle), ergänzt mit 10 μM ROCK-Inhibitor.
   8. Die Zellen werden auf Poly-Ornithin/Laminin- oder alternativ auf matrixbeschichtete Träger mit einer Dichte von 100.000 Zellen/^cm2 ausgesät. Verwenden Sie μ-Slide Kunststoffstützen mit Polymer-Deckglas (siehe Materialtabelle) für die Immunfärbeanalyse.
5. Wechseln Sie das Medium an Tag 6 auf frisches neuronales Medium ohne ROCK-Inhibitor. In den folgenden Tagen alle 3 Tage die Hälfte des Mediums auffrischen. Das Nährmedium muss sehr vorsichtig gewechselt werden, um ein Ablösen von der Oberfläche zu verhindern.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	Sigma-Aldrich	Nr. A6964-100ML	Reagenz zur Zelldissoziation
Nr. B27	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-093-566	Serumfreies Nahrungsergänzungsmittel für die Erhaltung neuronaler Zellen
Bambanker	Nippon Genetik	NGE-BB02	Zellgefriermedium, hier für Motoneuronen-Vorläuferzellen verwendet
BDNF	PreproTech	Nr. 450-02	Gehirn abgeleiteter neurotropher Faktor
Blastizidin	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 203350	Nukleosid-Antibiotikum, das die Proteinsynthese in Prokaryoten und Eukaryoten hemmt
Bsa	Sigma-Aldrich	Nr. A2153	Rinderserumalbumin. Blockierungsmittel zur Verhinderung der unspezifischen Bindung von Antikörpern in Immunfärbeassays
CaCl2	Sigma-Aldrich	Nr. C3881	Chemikalien für elektrophysiologische Lösungen
Corning Matrigel hESC-qualifizierte Matrix	Corning	354277	Chemikalien für elektrophysiologische Lösungen
CRYOSTEM ACF GEFRIERMEDIEN	Biologische Industrien	05-710-1E	Gefriermedium für humane iPSCs
D-Glukose	Sigma-Aldrich	Nr. G5146	Chemikalien für elektrophysiologische Lösungen
DAPT	AdipoGen	AG-CR1-0016-M005	Gamma-Sekretase-Hemmer
Dispase	Gibco	Artikel-Nr.: 17105-041	Reagenz zur schonenden Dissoziation humaner iPSCs
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: D6421-500ML	Basalmedium für die Zellkultur
doxycyclin	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Wird verwendet, um die Expression von Transgenen aus epB-BSD-TT-NIL- und epB-BSD-TT-NIP-Vektoren zu induzieren
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	Kommerzielle iPSC-Leitung für den Menschen
GDNF	PreproTech	Nr. 450-10	Neurotropher Faktor aus Gliazellen
Gibco Episomale hiPSC-Linie	Thermo Fisher Scientific	Nr. A18945	Kommerzielle iPSC-Leitung für den Menschen
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050038	Eine Alternative zu L-Glutamin mit erhöhter Stabilität. Verbessert die Zellgesundheit.
Hepes	Sigma-Aldrich	Nr. H4034	Chemikalien für elektrophysiologische Lösungen
L-Ascorbinsäure	LKT Laboratorien	Nr. A7210	Wird in der Zellkultur als Antioxidans verwendet
Laminin	Sigma-Aldrich	11243217001	Fördert die Anheftung und das Wachstum von Nervenzellen in vitro
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	Nicht-essentielle Aminosäuren. Wird als Ergänzung für Zellkulturmedium verwendet, um das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit zu erhöhen.
Neon 100 μL Kit	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Elektroporations-Kit für Zellen
Neon-Transfektionssystem	Thermo Fisher Scientific	MPK5000	Elektroporationssystem für Zellen
Neurobasales Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049	Basalmedium für die langfristige Erhaltung und Reifung neuronaler Zellpopulationen, ohne dass eine Astrozyten-Feeder-Schicht erforderlich
NutriStem-XF/FF	Biologische Industrien	05-100-1A	Humanes iPSC-Kulturmedium
Pbs	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: D8662-500ML	Dulbecco's Phosphatpuffer Kochsalzlösung, mit Calcium, mit Magnesium
PBS Ca2+/Mg2+ frei	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: D8537-500ML	Dulbecco's Phosphatpuffer Kochsalzlösung, ohne Calcium, ohne Magnesium
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	Nr. P4333-100ML	Penicillin/Streptomicin-Lösung, die verwendet wird, um eine Kontamination der Zellkultur durch Bakterien zu verhindern.
Poly-Ornithin	Sigma-Aldrich	Nr. P4957	Fördert die Anheftung und das Wachstum von Nervenzellen in vitro
Artikel-Nr.: SU5402	Sigma-Aldrich	SML0443-5MG	Selektiver Inhibitor des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptors 2 (VEGFR-2)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	Nr. T8787	4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl- polyethylenglykol, t- Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylenglykol tert- octylphenylether. Wird für die Zellpermeabilisierung in Immunfärbeassays verwendet
Y-27632 (ROCK-Inhibitor)	Enzo Biowissenschaften	ALX-270-333-M005	Zellpermeabler selektiver Inhibitor der Rho-assoziierten, Coiled-Coil enthaltenden Proteinkinase (ROCK). Erhöht das Überleben von iPS-Zellen
μ-Slide 8 Well	Ebd.	Nr. 80826	Unterstützung für die mikroskopische High-End-Analyse von fixierten Zellen