Generierung eines 3D-Co-Kulturmodells von humanen Hornhautfibroblasten und Neuronen

Zusammenfassung

Quelle: Sharif, R., et al. Corneal Tissue Engineering: Ein In-vitro-Modell der Stroma-Nerven-Interaktionen der menschlichen Hornhaut. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Generierung eines dreidimensionalen Co-Kultur-Modellsystems von primären menschlichen Hornhautfibroblasten und differenzierten neuronalen Zellen. Dieses Co-Kultur-System kann verwendet werden, um die Stroma-Nerven-Wechselwirkungen zu untersuchen.

Protokoll

>1. Primäre HCFs (humane Hornhautfibroblasten) Kultur und 3D-Konstrukte Assemblierung

1. Zusammenbau von 3D-Konstrukten aus Explantaten, die zuvor in EMEM gezüchtet wurden, 10% FBS, 1% Antibiotikum/Antimykotikum, Passage und Zählung von HCFs.
2. Aussaat von ca. 1 x 10⁶ Zellen/Well primärer HCFs auf Polycarbonat-Membraneinsätzen mit 0,4-μm-Poren aus den 3D-Konstrukten, zusammen mit 1,5 ml frischem EMEM, 10 % FBS, 1 % Antibiotikum/Antimykotikum auf der Oberseite des Konstrukts. Fügen Sie weitere 1,5 ml desselben Mediums an der Unterseite jedes Konstrukts hinzu.
3. Nach 24 Stunden Zellaussaat kultivieren Sie die Zellen mit EMEM 10 % FBS 1 % Antibiotikum/Antimykotikum, stimuliert mit 0,5 mM 2-O-α-D-Glucopyranosyl-L-ascorbinsäure (Vitamin C), indem Sie 1,5 ml auf die Oberseite und 1,5 ml auf die Unterseite jedes Konstrukts hinzufügen.
4. Halten Sie die Kulturen in einem Inkubator 3 Wochen lang bei 37 °C, 5 % CO₂ und liefern Sie während des gesamten Studienzeitraums jeden zweiten Tag frische Medien. Es ist keine weitere Passage erforderlich.

>2. Zelldifferenzierung und Co-Kulturen

1. Nach 3 Wochen fügen Sie 8 x 10³ Zellen/Vertiefung humaner SH-SY5Y-Neuroblastomzellen auf die zuvor zusammengesetzten 3D-Konstrukte hinzu, die 1,5 ml EMEM enthalten, das 10 % FBS, 1 % Antibiotikum/Antimykotikum und 0,5 mM 2-O-α-D-Glucopyranosyl-L-ascorbinsäure (Vitamin C) enthält.
   1. Lassen Sie die SH-SY5Y-Neuroblastomzellen mindestens 24 Stunden lang auf den Hornhautstromazellen wachsen, bevor Sie mit der Zelldifferenzierung beginnen.
2. Initiieren Sie die SH-SY5Y-Zelldifferenzierung, indem Sie die Zellen mit EMEM stimulieren, das 1 % FBS und 1,5 ml 10 μM Retinsäure auf dem Konstrukt enthält. Geben Sie 1,5 ml EMEM, 10 % FBS, 1 % Antibiotikum/Antimykotikum, 0,5 mM 2-O-α-D-Glucopyranosyl-L-ascorbinsäure (Vitamin C) an den Boden des Konstrukts. Beachten Sie, dass der Retinsäure-Schritt im Dunkeln durchgeführt werden sollte.
   1. Kultivieren Sie die Zellen weiterhin 5 Tage lang in diesem Differenzierungsmedium.
3. Wenn die Zellen die Differenzierungsphase erreichen, stellen Sie die Zellen auf 1,5 ml serumfreies Medium um, das 2 nM des vom Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktors (BDNF) und 1 % Antibiotikum/Antimykotikum enthält, das dem EMEM zugesetzt wird, indem Sie es an der Oberseite des Konstrukts hinzufügen. Geben Sie 1,5 ml EMEM, 10 % FBS, 1 % Antibiotikum/Antimykotikum, 0,5 mM 2-O-α-D-Glucopyranosyl-L-ascorbinsäure (Vitamin C) an den Boden des Konstrukts. Beachten Sie, dass der BDNF-Schritt im Dunkeln ausgeführt werden sollte.
4. Kultivieren Sie die Zellen für 2 weitere Tage, bevor Sie sie für weitere Analysen verarbeiten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dulbecco's Phosphat gepufferte Lösung (1X)	Gibco von Life Technologies	Nr. 14190-144
Sterile Pinzette	Fischer Scientific	Tel.: 13-812-42	Fisherbrand Präparierzange mit extra feiner Spitze
Einschneidige Rasierklingen	Personna	Artikel-Nr.: 270100
Sterile chirurgische Skalpellklingen Nr.10	Chirurgische Klinge für Federn	2976#10
Eagle's Minimum Essential Medium	ATCC	30-2003
Fötales Rinderserum	Atlanta Biologicals	Nr. S11550	10 % FBS werden für die Medienvorbereitung benötigt
Antibiotikum-Antimykotikum (100X)	Gibco von Life Technologies	Artikel-Nr.: 15240-062	1% Antibiotikum-Antimykotikum wird für die Medienvorbereitung benötigt
0,05 % Trypsin EDTA (1X)	Gibco von Life Technologies	25300062
Polycarbonat-Membraneinlagen mit 0,4 μm Poren	Corning Costar	3412
2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbinsäure (Vitamin C)	Sigma-Aldrich	SMB00390-14	Für die Studie sollte eine Konzentration von 0,5 mM verwendet werden
SH-SY5Y Neuroblastom-Zellen	ATCC	SHSY5YATCC CRL-2266
Retinsäure	Sigma-Aldrich	SRP3014-10UG	Die Endkonzentration von 10 μM muss verwendet werden
BDNF	Sigma-Aldrich	Nr. R2625-100MG	Die Endkonzentration von 2nM muss verwendet werden
Dimethylsulfoxid (DMSO)	VWR-Alfa Aesar	Tel.: 67-68-5	Ultra Pure Grade-Steriles DMSO zur Verwendung
Thermo Scientific Nunc mit Zellkulturen behandelte EasYFlasten (T25)	Fisher Scientific	Tel.: 12-565-351
Thermo Scientific Nunc mit Zellkulturen behandelte EasYFlasten (T75)	Fisher Scientific	Tel.: 12-565-349

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