Gewebeimmunfärbung für die bildgebende Massenzytometrie

Zusammenfassung

Das Video beschreibt die Vorbereitung einer Gewebeprobe für die bildgebende Massenzytometrie. Das Gewebe wird zunächst aufbereitet, um die Antigen-Epitope zu demaskieren, die Zellen zu permeabilisieren und unspezifische Antikörper-Bindungsstellen zu blockieren. Dann wird das Gewebe mit einem metallkonjugierten Antikörpercocktail und einer Kernfärbung inkubiert. Abschließend wird die behandelte Gewebeprobe mit einem optischen Scanner abgebildet.

Protokoll

>1. Vorbehandlung des Gewebes:

Für frisch gefrorene Taschentücher:

1. Stellen Sie ein Coplin-Glas aus Glas vor Gebrauch mindestens eine Stunde lang in den -20°C-Gefrierschrank.
2. Nehmen Sie die Objektträger aus dem -80°C-Gefrierschrank und legen Sie sie für mindestens 15 Minuten in das Coplin-Glasglas in den -20°C-Gefrierschrank.
3. Verwenden Sie unter dem Abzug einen Ampullenschneider, um die Glasampulle mit 16 % Paraformaldehyd (PFA) zu öffnen. Entsorgen Sie das zerbrochene Glas ordnungsgemäß.
4. Geben Sie 10 ml 16 % PFA und 30 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in ein Coplin-Plastikglas. Stellen Sie sicher, dass das PBS auf 4 °C vorgekühlt ist.
5. Diese Lösung für mindestens 15 Minuten in den 4 °C heißen Kühlschrank stellen.
6. Nach 15 Minuten das Coplin-Glas mit den Objektträgern für 10 Minuten in den 4 °C kühlen Kühlschrank stellen.
7. Übertragen Sie die Objektträger aus dem Glas in das Coplin-Plastikglas mit der kalten 4%igen PFA-Lösung.
8. Die Objektträger mit 4% PFA für 30 Minuten im Kühlschrank fixieren.
9. Spülen Sie die Objektträger dreimal jeweils 5 Minuten lang bei Raumtemperatur PBS und stellen Sie sicher, dass sie zwischen den Zyklen gründlich gespült werden.

Für FFPE-Gewebe:

1. Beginnen Sie mit den 5 μm großen Formalin-fixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeschnitten, die auf den positiv geladenen Standard-Objektträgern montiert sind.
2. Entwachsen Sie die Objektträger, indem Sie sie eine Stunde lang auf 60 °C erhitzen.
3. Nehmen Sie die Objektträger heraus und kühlen Sie sie ca. 5 Minuten lang auf Raumtemperatur ab.
4. Legen Sie die Objektträger in eine Objektträger-Versandtasche und spülen Sie sie zweimal 3 Minuten lang in einem Xylolbad aus.
5. Spülen Sie die Objektträger erneut zweimal 1 Minute lang mit 100% Ethanol aus.
6. Spülen Sie die Objektträger auf ähnliche Weise jeweils 1 Minute lang mit 95 % und 70 % Ethanol.
7. Zum Schluss zweimal 3 Minuten lang in destilliertem Wasser abspülen.
   Anmerkung: Das Hyperion kann nicht innerhalb von 2 mm von der Gleitkante abtragen, das Gewebe so weit wie möglich zentrieren.

>2. Wärmeinduziertes Abrufen von Epitopen (HIER)

1. Bereiten Sie Tris-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pH9-Puffer vor:
   1. Abcam ab93684 Tris-EDTA pH9 HIER Puffer wird zu einer 100-fachen Dosierung gekauft und auf 1x in Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)-Wasser verdünnt.
   2. Beispiel: 2,5 ml Abcam ab93684 in 247,5 ml HPLC-Wasser.
      Anmerkung: Puffer, der älter als sechs Monate ist, sollte nicht verwendet werden.
2. Richten Sie eine Enttarnungskammer zum Erhitzen der Objektträger ein. Füllen Sie zunächst den Boden der Kammer mit 500 mL Leitungswasser. Geben Sie dann 250 ml Leitungswasser in die seitlichen Behälter und 200 ml Leitungswasser in den zentralen Behälter.
3. Legen Sie bis zu 3 Folien in einen 5-Platz-Folienversand.
4. Füllen Sie den Objektträgerversand mit dem HIER-Puffer, bis das Gewebe vollständig untergetaucht ist. Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass der Schiebeversand ein kleines Loch in der Oberseite hat, um Dampf abzulassen und eine Druckbeaufschlagung zu verhindern.
5. Führen Sie "Programm 4" 20 Minuten lang bei 95 °C durch.
6. In der Zwischenzeit die Inkubationskammern für die nachfolgenden Schritte vorwärmen (siehe Schritt 3.5)
7. Entfernen Sie nach der Inkubation die Versandtasche und legen Sie sie in eine Wanne mit kaltem Wasser aus dem Wasserhahn.
8. 5 Minuten abkühlen lassen.
9. Entfernen Sie die Hälfte des Puffers aus dem Versandbehälter und ersetzen Sie ihn durch destilliertes Wasser. 5 Minuten abkühlen lassen.
10. Entfernen Sie nach und nach den Puffer und erhöhen Sie das Wasservolumen zweimal, jeweils mit einer 5-minütigen Kühlperiode.
11. Zum Schluss spülen Sie die Objektträger in 100 % destilliertem Wasser ab.

>3. Blockieren der unspezifischen Bindung

1. Bereiten Sie den Blockierungspuffer (Tris-gepufferte Kochsalzlösung oder TBS, 0,1 % Triton X-100, 3 % Rinderserumalbumin oder BSA) vor, indem Sie 150 μl TBS mit 10 % BSA zu 350 μl TBS mit 0,1 % Triton X-10,
   Anmerkung: TBS mit 10% BSA wird bei -20 °C gelagert und sollte jedes Mal frisch aufgetaut werden.
2. Waschen Sie die Objektträger mit einem Objektträgerversand oder Coplin-Tiegeln zweimal 5 Minuten lang in TBS, 0,1 % Triton X-100.
3. Nehmen Sie die Folie aus dem Mailer und verwenden Sie ein Kim-Tuch, um alle Puffer außerhalb des PAP-Kreises zu entfernen. Lassen Sie ~1 Minute etwas trocknen.
4. Geben Sie mit einem P200 ein paar Tropfen des Blockierungspuffers über das Gewebe, gerade genug, um es zu bedecken. Die PAP-Leitung sollte die Flüssigkeit über dem Gewebe halten.
   Anmerkung: Wenn der Puffer nicht im PAP-Kreis eingeschlossen ist, ziehen Sie den PAP-Kreis erneut um das Gewebe, um einen späteren Antikörperverlust zu vermeiden.
5. Inkubieren Sie den Objektträger bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeitskammer für 1 Stunde.
   Anmerkung: Eine leere Pipettenspitzenbox eignet sich gut für eine Feuchtigkeitskammer. Stellen Sie sicher, dass sich eine kleine Menge Leitungswasser am Boden befindet.

>4. Färben mit metallkonjugierten Antikörpern

1. Die metallkonjugierten Antikörper bei 4 °C entfernen und 1 Minute bei 10.000 x G zentrifugieren.
2. Vorbereitung einer optimalen Verdünnung des Antikörper-Mastermixes in TBS, 0,1 % Triton X-100 und 1 % BSA-Mischung.
   HINWEIS: a) Die optimale Verdünnung jedes Antikörpers muss experimentell bestimmt werden und ist einer der wichtigsten Schritte für erfolgreiche bildgebende Massenzytometrie-Experimente. Verwenden Sie eine Excel-Tabelle, um das Volumen zu berechnen. Produzieren Sie nur geringfügig mehr als aufgrund der Antikörperkosten erforderlich. Wenn z.B. 200 μl Blocking-Puffer benötigt werden, machen Sie einen 250 μl Mastermix. b) Der Mastermix sollte während des Blockierungsschritts für jeden Versuch frisch zubereitet werden.
3. Nach der Inkubation (siehe Schritt 3.5) nehmen Sie den Objektträger aus dem Inkubator.
4. Entfernen Sie überschüssigen Blockierungspuffer, indem Sie mit dem Schieber vertikal und horizontal auf die Kim-Tücher tippen. Dies sollte einen gewissen Blockierungspuffer auf dem Gewebe hinterlassen, aber das meiste davon entfernen.
5. Lassen Sie ~1 Minute etwas trocknen.
6. Stellen Sie den Objektträger bei 4 °C in die Feuchtigkeitskammer und lassen Sie ihn ausgleichen.
7. Pipettieren Sie dann den Antikörper-Mastermix vorsichtig auf das Gewebe und achten Sie dabei äußerst darauf, dass die Lösung im PAP-Kreis enthalten ist.
8. Schließen Sie die Feuchtigkeitskammer und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C.
9. Nach der Inkubation über Nacht den Objektträger bei 4 °C entfernen und überschüssigen Mastermix entfernen, indem Sie den Objektträger vertikal und horizontal auf die Kim-Tücher klopfen.
10. Legen Sie den Objektträger in den Versandbehälter oder das Coplin-Glas und waschen Sie ihn 5 Minuten lang mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS, ergänzt mit 0,2 % Triton X-100, zweimal.
11. Waschen Sie dann den Objektträger zweimal 5 Minuten lang in PBS. Nehmen Sie den Objektträger heraus und lassen Sie ihn ca. 1 Minute trocknen.

>5. DNA-Interkalation

1. Für die DNA-Interkalation verdünnen Sie den Interkalator-Ir 1:1000 in PBS.
2. Pipettieren Sie den verdünnten Interkalator vorsichtig auf das Gewebe und achten Sie dabei äußerst darauf, dass die Lösung im PAP-Kreis enthalten ist.
3. 30 Minuten bei Raumtemperatur in der Feuchtigkeitskammer inkubieren, die zum Blockieren verwendet wird.
4. Tippen Sie danach vertikal und horizontal auf die Objektträger der Kim-Tücher, um überschüssigen Intercalator-Ir-Farbstoff zu entfernen.
5. Legen Sie den Objektträger in den Versandbehälter oder das Coplin-Glas und waschen Sie ihn zweimal 5 Minuten lang mit HPLC-Wasser.
6. Trocknen Sie die Objektträger vor dem Scannen 5 Minuten lang in einem Exsikkator.

>6. Scannen von Bildern

1. Verwenden Sie zum Scannen von Objektträgern einen Glasätzer mit Hartmetallspitze, um vier schwache Xs in den Objektträger zu ritzen. Präzise Lernpunkte ermöglichen die beste Bildregistrierung.
   Anmerkung: Kommen Sie der Kante nicht zu nahe.
2. Scannen Sie mit einem Flachbett-Dokumentenscanner mit nicht weniger als 1200 Punkten pro Zoll
3. Schneiden Sie dieses Bild so nah wie möglich an den Folienrändern zu und speichern Sie es auf einem Flash-Laufwerk.
4. Für die Mitregistrierung von Bildern scannen Sie das Objektträger auf einem Hamamatsu NanoZoomer mit "Pre_IMC" im Dateinamen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Gewebe-Immunfärbeverfahrens für die bildgebende Massenzytometrie

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ausrüstungen
Coplin-Gläser
5-Schiebe-Versandtasche aus Kunststoff mit Entlüftungsloch
Antigen-Rückholgerät (Enttarnungskammer)
Scanner
Chemikalien & Enzyme:
Xylol
200 Proof Ethanol
HPLC Wasser
Abcam ab93684 Tris-EDTA pH9 HIER Puffer
Tbs
TBS mit 0,1 % Trition X-100
TBS mit 10% BSA
Pbs
PBS mit 0,2 % Trition X-100