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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Vorbereitung der Scheibe
- Bauen Sie eine Schicht-Rückgewinnungskammer oder besorgen Sie sie.
HINWEIS: Das Prinzip für eine Aufwachkammer ist einfach und kann im Labor hergestellt werden (Abbildung 1). Kurz gesagt, die Kammer ist ein Behälter, in den ein Korb eingesetzt wird, um die Hirnschnitte auf einem Niveau zu halten, das niedriger ist als die Oberfläche von künstlichem Liquor cerebrospinalis (aCSF).
- Nehmen Sie als Beispiel vier Ringe (4 - 6 mm hoch) (Abbildung 1A, Seitenansicht; B, Draufsicht) durch Schneiden einer 30-cm³-Spritze. Kleben Sie dann gespannte Netze (z. B. aus einem Nylonschlauch geschnitten) an eine Seite der Ringe, um die Gehirnschnitte zu halten (Abbildung 1B), und kleben Sie die Ringe zusammen.
HINWEIS: Es kann eine Klebepistole verwendet werden.
- Sobald die vier Ringe verklebt sind, kleben Sie eine gebogene, gleichschenklige trapezförmige Kunststoffwand auf zwei der Ringe (Abbildung 1A und B), um Sauerstoffblasen von den sich erholenden Gehirnschnitten abzuleiten (Abbildung 1C und D). Wie in Abbildung 1D gezeigt, setzen Sie ein Sauerstoffdiffusionssystem (hier ein Gasdispersionsrohr) auf der gleichen Seite wie die Kunststoffwände ein.
- Vor dem Schneiden die Schnittlösung mit Sauerstoff versorgen (95 % Ø2/5 % CO2) und auf 0 - 2 °C abkühlen (siehe Schritt 1.4).
- Füllen Sie die benutzerdefinierte Rückgewinnungskammer mit Standard-aCSF bei Raumtemperatur (RT). Stellen Sie sicher, dass der aCSF gut mit Sauerstoff versorgt ist (20 - 30 min, die Zeit kann je nach Kammervolumen variieren), bevor Sie die Scheiben in die Aufwachkammer legen. Achten Sie darauf, dass Gasblasen nicht in direkten Kontakt mit den Scheiben kommen oder diese stören.
- Legen Sie die Vibratome-Eisschale mit Eis aus und füllen Sie sie mit kaltem Wasser, so dass ein Drittel bis die Hälfte der Schneidekammer untergetaucht ist. Platzieren Sie vorsichtig ein Sauerstoffzufuhrsystem (z. B. einen gasdiffundierenden Stein) und einen Temperaturfühler in der Schneidkammer, so dass keines der beiden Elemente die Klingenbewegung oder die Scheibenmanipulation beeinträchtigt.
- Bereiten Sie den Präparierbereich und die Werkzeuge vor, die für die Entnahme des Gehirns und die Präparierung der gewünschten Hirnregion erforderlich sind.
HINWEIS: Die genaue Dissektion, die durchgeführt wird, hängt von der untersuchten Gehirnregion ab, da unterschiedliche Gehirnstrukturen in verschiedenen Ebenen geschnitten werden müssen (z. B. koronale, sagittale oder horizontale Schnitte).
- Legen Sie die folgenden Werkzeuge auf eine Unterlage: Enthauptungsschere, Skalpell, kleine Schere mit gerader, scharfer Spitze, Gefäßkanülenzange (oder ein beliebiges chirurgisches Werkzeug mit breiter Spitze, wie z. B. Rongeure, das eher für Rattenschädel geeignet ist), gebogene hämostatische Pinzette, Pinzette, Spatel, Schöpfspatel, Filterpapier, Petrischale, einschneidige Rasierklinge und Cyanacrylatkleber.
- Wenn die Temperatur 0-2 °C erreicht, die Schneidlösung in die Schneidekammer (Pufferschale) umfüllen.
- Betäuben Sie die Maus in einer Austrocknungskammer mit Isofluran. Die genaue Menge kann je nach Größe der verwendeten Kammer variieren, aber für einen kleinen Schuhkartonkäfig verwenden Sie ein paar Tropfen (~3-4). Lassen Sie die Maus im Käfig, bis sie unbeweglich wird (nicht auf taktile Reize reagiert; ca. 15 Sekunden unter den hier beschriebenen Bedingungen). Führen Sie Schwanz- und Fußquetschtests durch, um sicherzustellen, dass das Tier tief betäubt wird, und enthaupten Sie es dann, bevor das Herz aufhört zu schlagen (verbessert die Lebensfähigkeit der Zellen).
HINWEIS: Einige Laboratorien erhalten mit entsprechender Begründung die Genehmigung zur Lebendenthauptung, um exzitotoxische Prozesse so weit wie möglich zu minimieren und die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern.
- Führen Sie die Sektion durch.
HINWEIS: Das Gehirn muss schnell extrahiert werden (<45 Sekunden).
- Schneiden Sie mit dem Skalpell die oberflächliche Haut auf dem Schädel von rostral bis kaudal ab.
- Schälen Sie die Kopfhaut auf jeder Seite des Kopfes.
- Schneide mit einer kleinen, geraden, scharfen Schere die interparietale Platte entlang der Lambdoideus-Naht, um das Kleinhirn zu entfernen. Entfernen Sie das Hinterhauptbein.
- Schneiden Sie mit der gleichen Schere die sagittale Naht ab.
- Schieben Sie die Kanülenzange (oder Rongeure, wenn Sie einen Rattenschädel brechen) unter jeden Scheitelknochen und ziehen Sie, um das Gehirn freizulegen.
- Kneifen Sie mit der gebogenen hämostatischen Pinzette in die Stirnknochen, um sie zu brechen, und entfernen Sie dann mit einer Pinzette oder einer Gefäßkanülenzange die gebrochenen Knochen. Schneiden und entfernen Sie die Dura mater so vorsichtig wie möglich, da sie die Dissektion beeinträchtigen kann.
- Schieben Sie den Spatel unter das Gehirn und ziehen Sie ihn vorsichtig aus dem Schädel. Legen Sie es in die zuvor mit eiskaltem aCSF gefüllte Schneidekammer (Pufferschale). Lassen Sie das Gehirn 1-2 min abkühlen.
- Bereiten Sie die Sezierplattform vor, indem Sie eine Petrischale mit Eis und etwas Eiswasser füllen, um einen besseren Oberflächenkontakt zu ermöglichen. Decken Sie die Schale mit dem Deckel ab und legen Sie Filterpapier darauf. Befeuchten Sie das Filterpapier mit kaltem aCSF.
- Sobald das Gehirn abgekühlt ist, legen Sie das Gehirn auf die mit Eis gefüllte Petrischale und führen Sie schnell die entsprechende Dissektion durch, um die gewünschte Schnittebene zu erhalten.
- Um sagittale Schnitte zu erhalten, die den Nucleus accumbens (NAc) enthalten, verwenden Sie eine einschneidige Rasierklinge, um die Riechtuberkel und das Kleinhirn zu schneiden und zu entfernen, falls sie noch vorhanden sind. Anschließend wird ein sagittaler Schnitt von 2-3 mm vom lateralen Rand der rechten Halbkugel durchgeführt, um die ebene Oberfläche zu erhalten, die auf die Probenaufnahmeplatte geklebt wird (siehe Schritt 1.8.11).
HINWEIS: Wenn Sie nur 2 - 3 mm vom seitlichen Rand der Halbkugel entfernt schneiden, können Scheiben mit dem NAc von beiden Halbkugeln entnommen werden. Die geeignete Dissektion hängt von der untersuchten Hirnregion ab. Hier wird die Dissektion durchgeführt, damit NAc-Neuronen in sagittalen Hirnschnitten aufgezeichnet werden können.
- Kleben Sie die flache Schnittfläche des Gehirns schnell (mit Cyanacrylatkleber, der auf die Probenaufnahmeplatte aufgetragen wird) entsprechend der gewünschten Schnittebene auf die Platte. Zur Gewinnung von sagittalen Hirnschnitten siehe Schritt 1.8.10.
- Platzieren und fixieren Sie die Probenaufnahmeplatte sofort in der Schneidekammer, so dass das Gehirn rostro-kaudal geschnitten wird (aus Sicherheitsgründen stellen Sie den Klingenhalter nur auf, wenn die Probenplatte gesichert ist).
- Stellen Sie das Vibratom mit den entsprechenden Slicing-Parametern ein (Parameter, die im Labor für das in den Materialien erwähnte Vibratom verwendet werden: Geschwindigkeit 3 - 4, Vibration 9-10 und Schichtdicke 250 μm).
- Nach dem Schneiden verwenden Sie eine mit Kunststoff beschnittene Transferpipette, um die Gehirnschnitte in die Aufwachkammer (bei RT) zu übertragen (siehe Schritt 1.3). Die Erholungszeit kann je nach untersuchtem neuronalen Typ variieren (typischerweise 30 - 90 Minuten).
>2. Aufzeichnen von Mikropipetten und Vorbereitung des Rigs
- Beziehen Sie sich auf die spezifischen Richtlinien in der Bedienungsanleitung des Abziehers, um die gewünschten Eigenschaften der Mikropipette zu erhalten.
HINWEIS: Für MSNs verwenden wir einen Pipettenwiderstandsbereich von 3,2-4,0 MΩ.
- Versorgen Sie den aCSF mit Sauerstoff und stellen Sie den Durchfluss auf 2 ml/min ein. Vakuumieren Sie den aCSF mit einer Schlauchpumpe oder Vakuumleitungen, die in der Anlage installiert sind.
- Schalten Sie den Regler der Perfusionsheizung ein und passen Sie die Temperatureinstellungen an, um die gewünschte Temperatur zu erreichen (z. B. 31,8-32,2 °C).
HINWEIS: Die Temperaturstabilität hängt sowohl von einem konstanten aCSF-Spiegel als auch von einer konstanten Strömungsgeschwindigkeit in der Kammer ab. Da mehrere biophysikalische Eigenschaften von Neuronen (z.B. Eingangswiderstand, Ri, auch Membranwiderstand genannt, Rm) temperaturempfindlich sind, ist die Aufrechterhaltung einer stabilen Temperatur wichtig.
- Schalten Sie den computergesteuerten Verstärker, die Kamera, den Mikromanipulator und das Hintergrundlicht des Mikroskops ein. Wenn Sie ein Experiment durchführen, das eine elektrische Stimulation des Gewebes erfordert, schalten Sie den Stimulusregler und die Isolationseinheit ein.
HINWEIS: Einige Verstärker anderer Hersteller empfehlen ein "Aufwärmen" vor dem Gebrauch, daher empfiehlt es sich, die genaue Betriebsanleitung im Handbuch zu konsultieren.
- Starten Sie die Kameraerfassung, die Signalerfassung und die Verstärkersoftware.
- Platzierung und Visualisierung von Schichten:
- Ziehen Sie mit einer Kunststoffpipette mit abgeschnittener Spitze vorsichtig ein Gehirnstück aus der Aufwachkammer ein.
- Setzen Sie die Transferpipette in die Aufnahmekammer ein und drücken Sie die Scheibe vorsichtig aus der Pipette auf das Deckglas, das den Boden der Kammer auskleidet.
HINWEIS: Solange kein Überlauf auftritt, ist es unbedenklich, dass etwas Liquor aus der Auffangkammer in das Bad gelangt.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um die Position des Slices so zu ändern, dass der gewünschte Bereich genau in der Mitte der Aufnahmekammer platziert wird. Verwenden Sie das Low-Power-Objektiv (4X) des Mikroskops und das Okular zur Unterstützung bei der Positionierung.
- Nachdem die gewünschte Position erreicht wurde, fixieren Sie die Position des Hirnschnitts mit einem Scheibenhalter (auch "Harfe" genannt) in der Kammer.
- Wechseln Sie zu einem Hochleistungsobjektiv (40X) und senken Sie es vorsichtig ab, bis sich ein Kontakt mit dem aCSF in der Kammer gebildet hat.
- Verwenden Sie das Feineinstellrad, um das Gewebe scharf zu stellen. Wenn Sie mit dem aCSF in Kontakt kommen, verwenden Sie das grobe Einstellrad am Mikroskop nicht, da ein übermäßiges Absenken der Objektivlinse die Scheibe zerquetschen oder sogar den Deckglas, der den Boden der Kammer auskleidet, beschädigen kann, was dazu führen kann, dass aCSF auf den Kondensor gelangt und ihn beschädigt.
- Wenn der Fokus auf Gewebeebene liegt, beobachten Sie die Zellen in der Zielregion, um ihre Form zu erkennen. Tote Zellen sind leicht an ihrer geschwollenen Plasmamembran und ihrem Zellkern zu erkennen (Abbildung 1E). Gesunde Zellen sollten als runde, eiförmige oder elliptische homogene Strukturen erscheinen (Abbildung 1E).
- Suchen Sie nach einer Zielzelle. Markieren Sie es auf dem Computerbildschirm, um die Aufzeichnungsmikropipette zu führen. Wenn Sie Software wie QCapture verwenden, zeichnen Sie ein Quadrat um die Zielzelle, indem Sie die linke Maustaste gedrückt halten.
- Heben Sie die Objektivlinse so an, dass in dem Kegel, der durch den Kontakt der Objektivlinse mit dem aCSF gebildet wird, genügend Platz zum Platzieren und Bewegen der Aufzeichnungsmikropipette vorhanden ist.
- Platzierung und Positionierung von Mikropipetten
- Füllen Sie eine Mikropipette mit einer 1-ml-Spritze, einer nichtmetallischen Mikrospritzennadel und einem speziellen Filter mit der internen Lösung, die zuvor gemäß dem geplanten Versuch hergestellt wurde (K+-basierte oder Cs+-basierte interne Lösung, siehe Materialien für die Zusammensetzung). Verwenden Sie so viel Lösung, dass die innere Lösung mit der chloridbeschichteten Silberdrahtelektrode im Mikropipettenhalter in Kontakt kommt.
HINWEIS: Die Silberdrahtelektrode kann chloriert werden, indem sie in Haushaltsbleiche eingeweicht wird. Nukleosidtriphosphate (Adenosintriphosphat, ATP und Guanosintriphosphat, GTP) können der internen Lösung vor der Verwendung zugesetzt werden. Bewahren Sie die Spritze mit der Lösung auf Eis auf, um einen ATP/GTP-Abbau zu verhindern.
- Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Mikropipette befinden, da diese austreten können, während sich die Mikropipette im Gewebe befindet, und die Scheibe verdecken können.
- Setzen Sie die Mikropipette so in den Elektrodenhalter ein, dass die Lösung mit der mit Silberchlorid beschichteten Drahtelektrode in Kontakt kommt.
- Ziehen Sie die Pipettenkappe so fest, dass die Kegelscheibe eine Abdichtung um die Mikropipette bildet.
- Üben Sie Überdruck aus, bevor Sie die Mikropipette in den aCSF eintauchen, um zu verhindern, dass Schmutz in die Pipette gelangt.
- Platzieren Sie den Kopftisch in der verriegelten Position (mit Blick auf die Kammer) und führen Sie ihn mit dem Mikromanipulator nach unten in Richtung der Kammer, so dass er sich ungefähr unter der Mitte des eingetauchten Objektivs befindet.
- Während Sie die Mikropipette mit dem Mikromanipulator (auf mittlere bis hohe Geschwindigkeit eingestellt) bewegen, verwenden Sie den Computerbildschirm, um die Mikropipette zu lokalisieren und sie in Richtung der Position der Zelle auf der X-Y-Achse zu führen.
- Messen Sie den Widerstand der Mikropipette durch Anlegen eines Spannungsschritts (z. B. 4 mV für 100 ms), der manuell oder automatisch über eine spezielle Software wie den "Bad"-Modus bei Verwendung von "Membrantest" in der Clampex-Software durchgeführt werden kann (siehe auch Schritt 4). Um sicherzustellen, dass keine Luftblasen oder andere Fremdkörper die Mikropipette blockieren, üben Sie mit der luftgefüllten Spritze (z. B. 30-cm³-Spritze), die mit einem Polyethylenschlauch mit dem Mikropipettenhalter verbunden ist, einen Überdruck aus.
- Führen Sie nach dem Löschen der Mikropipette einen Spannungsoffset durch, um den Pipettenstrom auf Null zu reduzieren, was manuell oder über eine spezielle Software wie "Pipetten-Offset" auf dem computergesteuerten Verstärkerbefehl erreicht werden kann.
HINWEIS: Diese Funktion kompensiert alle Spannungen, die durch Konzentrationsunterschiede zwischen dem Bad und der Mikropipettenlösung verursacht werden (d. h. Sperrschichtpotential).
>3. Membrantest
HINWEIS: Dieser Schritt gilt für den Verstärker, der in den Materialien erwähnt wird.
- Wenn Sie eine computergesteuerte Verstärkersteuerung verwenden, stellen Sie diese immer auf den Voltage-Clamp-Modus, um den Membrantest durchzuführen.
HINWEIS: Wenn der Membrantest auf den "Bad"-Modus eingestellt ist, ermöglicht der Membrantest die Messung des Mikropipettenwiderstands und des Dichtungswiderstands beim Formen der Dichtung.
- Sobald die Membran gerissen ist (siehe Schritt 4.8), schalten Sie den Membrantest in den "Zell"-Modus, so dass der Serienwiderstand (Rs) (auch Zugangswiderstand Ra), Ri und die Membrankapazität (Cp) erhalten werden können.
>4. Endannäherung, Dichtungsbildung und Erreichen der Ganzzellkonfiguration
- Beginnen Sie mit dem Feinfokussierrad mit dem Fokussieren nach unten, während Sie die Mikropipette allmählich absenken. Fokussieren Sie immer zuerst nach unten und senken Sie dann die Mikropipette bis zur Fokusebene ab. Dadurch wird sichergestellt, dass die Spitze der Mikropipette nicht abrupt in die Scheibe eindringt.
- Wenn die Mikropipette mit der Oberfläche der Scheibe in Berührung kommt, verlangsamen Sie die Geschwindigkeit des Mikromanipulators auf den mittleren bis niedrigen Modus.
- Üben Sie vorsichtig einen leichten Überdruck aus, während die luftgefüllte Spritze mit dem Pipettenhalter verbunden ist, um Schmutz aus dem Zustiegsweg zu entfernen.
- Nähern Sie sich der Zelle, indem Sie entweder mit den X-Y-Z-Drehreglern wechseln oder indem Sie sich diagonal nähern (wenn das Mikromanipulatormodell dies zulässt), wobei beide X-Z-Achsen durch die Drehung des Z-Achsen-Knopfes geändert werden. Die letztere Methode verhindert eine vertikale Kompression des Gewebes.
HINWEIS: Hier besteht das Ziel darin, sich der Zelle zu nähern, indem der Scheibe nur minimaler Schaden zugefügt wird. Wenn sich die Mikropipette nahe genug an der Zelle befindet, entsteht ein Grübchen (eine runde Verfärbung der Zelloberfläche, die durch den positiven Druck verursacht wird, der durch die Spitze der Mikropipette ausgeübt wird) (Abbildung 2).
- Wenn das Grübchen auftritt (Abbildung 2-1), saugen Sie schwach und kurz durch das Rohr, das mit dem Saugrohr des Pipettenhalters verbunden ist, um die Abdichtung herzustellen (Abbildung 2-2). Überwachen Sie den Membrantest weiter.
HINWEIS: Wenn eine partielle Dichtung gebildet wird (<1 GΩ), kann das Einspeisen negativer Ströme durch Verringern des Haltepotentials (am computergesteuerten Verstärker-Commander) die Dichtungsbildung erleichtern und einen Gigaohm-Widerstand erreichen ("Gigaohm-Dichtung" oder "Gigaseal" >1 - 5 GΩ). Der hohe Widerstand der Dichtung (>1 GΩ) begrenzt sowohl die Störverzerrung des aufgezeichneten Signals als auch trägt zur mechanischen Stabilität des Patches bei.
- Während sich ein Gigaseal bildet, verwenden Sie den computergesteuerten Verstärker-Commander, um das Haltepotenzial der Zelle so nah wie möglich an das physiologische Ruhepotenzial (V-Ruhe) zu bringen, um plötzliche Veränderungen zu verhindern, sobald die Membran gerissen ist. Zum Beispiel werden MSNs in der Regel bei -70 oder -80 mV spannungsgeklemmt (physiologischerV-Rest: -70 bis -90 mV).
- Nachdem sich der Gigaseal gebildet hat, kompensieren Sie die schnelle und langsame Kapazität manuell oder automatisch. Wenn Sie eine computergesteuerte Verstärkersteuerung wie z. B. die Multiclamp-Steuerung verwenden, drücken Sie "Auto" für "Cp Fast" und "Cp Slow".
- Wenn die Dichtung stabil bleibt und über 1 GΩ liegt (oder weniger als 10 - 20 pA injiziert wird, um die Zelle auf dem gewünschten Membranpotential zu halten), wird ein kurzer und starker Sog durch dasselbe Rohr wie in 4.5 angewendet, um die Plasmamembran zu durchbrechen (Abbildung 2-3).
HINWEIS: Dies kann mehrere Versuche erfordern. Ein guter Membranbruch wird erreicht, wenn die Saugung stark genug durchgeführt wird, damit die gerissene Membran die Mikropipette nicht verstopft (was zu einem Anstieg von Rs während der Aufzeichnung führen kann), aber schwach genug, um keinen großen Teil der Membran oder der Zelle einzuziehen.
- Überwachen Sie nach Erreichen einer erfolgreichen Ganzzellkonfiguration regelmäßig die Position der Mikropipette, um eine signifikante Drift zu beurteilen und zu korrigieren, da dies zum Verlust des Pflasters führen kann. Die Driftamplitude kann in Abhängigkeit von mehreren Faktoren variieren, z. B. von der Qualität der Installation des Bohrgeräts und den Zugkräften auf den Kopftisch. Im Idealfall sollte die Drift fast nicht vorhanden sein.
- Durch Umschalten in den "Zell"-Modus im Membrantest können Sie verschiedene Parameter der Zelle wie Ri, Rs und Cp anzeigen. Überwachen Sie diese Parameter während der Aufnahme.
HINWEIS: Alle diese Parameter können helfen, den anfänglichen Gesundheitszustand der Zellen und Zelltypen zu beurteilen (siehe Abschnitt "Membrantest", Schritt 4).
