$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Vorbereitung der Lösungen
- Standardmäßige künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF; Tabelle 1)
- Verwenden Sie hochreine Salze und reinigen Sie Bechergläser, die zuvor mit doppelt destilliertem Wasser gespült wurden, um eine frische Lösung herzustellen. Verwenden Sie für die Herstellung aller extra- und intrazellulären Lösungen hochwertiges doppelt destilliertes Wasser.
- Gemäß Tabelle 1 wird ein 2-Liter-Becherglas verwendet, um NaHCO3 in 500 ml Wasser aufzulösen, und ein weiteres zum Auflösen der anderen Salze, um die Ausfällung zweiwertiger Ionen zu verhindern. Reinigen Sie den Spatel systematisch mit doppelt destilliertem Wasser und trocknen Sie ihn ab, bevor Sie ein Salz nehmen. Verwenden Sie einen Magnetrührer, um die Auflösung zu homogenisieren. Die Lösungen aus beiden Bechern werden in einen geeigneten Messkolben gegeben und auf das entsprechende Volumen gebracht.
- Stellen Sie sicher, dass die extrazelluläre vollständig transparent und ohne Spuren von Niederschlag ist.
- Tragen Sie ein Gasgemisch aus 95 % O2 und 5 % CO2 (Carbogengas) mit einer Glasmikrofilterkerze (Ø 13 mm) 20 - 30 min vor der Durchblutung der Scheiben auf. Kontrollieren Sie die Osmolarität (2 - 3 aufeinanderfolgende Messungen) des ACSF sorgfältig mit einem Osmometer (optimaler Bereich: 314 - 325 mOsmol/L). Lagern Sie die restliche Lösung nach der Zubereitung bei 4 °C und verwenden Sie sie innerhalb von 3 Tagen.
- Schneidlösung (Saccharose-ACSF; Tabelle 2)
- Bereiten Sie 3 l frische Lösung vor. Verwenden Sie 1 l, um Gehirnschnitte von einem Tier zuzubereiten. Die restliche Lösung bei 4 °C lagern und innerhalb von 3 Tagen verbrauchen.
HINWEIS: Hohe Mg2+ und niedrige Ca2+ Konzentrationen werden verwendet, um die synaptische Übertragung zu verringern, und etwas NaCl wird durch Saccharose ersetzt, um das Gewebe zu erhalten.
- Intrazelluläre Lösungen
- Bereiten Sie im Voraus 100 ml-Lösung für duale Ganzzellaufnahmen vor (Tabelle 3).
- Fügen Sie Methylsulfat hinzu, um eine gute Wiederherstellung der Zellmorphologie zu erzielen. Fügen Sie Biocytin (0,1 - 0,4%) hinzu, um anschließend die Morphologie des Neurons zu untersuchen. Fügen Sie einen Fluoreszenzfarbstoff (z. B. Alexa 594 oder Sulforhodamin 101 41) hinzu, um die Ausdehnung der Dendriten während der Aufzeichnung zu verfolgen (optional).
- Bereiten Sie im Voraus 100 mL Elektrodenlösung für zellgebundene Aufzeichnungen vor (Tabelle 4). In diesem Fall handelt es sich bei der internen Lösung um eine High-K+-Lösung, die den makroskopischen, hyperpolarisationsaktivierten Kationenstrom (Ih) isoliert und Blocker für die anderen spannungsgesteuerten Ionenkanäle enthält.
- Lagern Sie intrazelluläre Lösungen in 2-ml-Aliquoten bei -20 °C. Verwenden Sie für jede neue Aufnahmesitzung ein neues Aliquot. Überprüfen Sie die Osmolarität jedes aufgetauten Aliquots sorgfältig mit einem Osmometer. Nehmen Sie ein neues Aliquot, wenn die Osmolarität nicht dem Anfangswert entspricht.
- Die Lösung aus dem Aliquot wird in eine 3-ml-Spritze überführt, auf die ein steriler 0,22-μm-Spritzenvorsatzfilter aufgesetzt wird. Halten Sie die Spritze während der Aufnahmesitzung auf Eis, um den Abbau ihrer Verbindungen (ATP, GTP oder Phosphokreatin) zu begrenzen.
>2. Herstellung und Befüllung von Patch-Pipetten
- Ziehen
- Verwenden Sie einen horizontalen Elektrodenabzieher und ein dickwandiges Borosilikatglasrohr. Verwenden Sie für Ganzzell- und Zell-Attached-Aufnahmen einen Außendurchmesser von 2 mm / 1 mm Innendurchmesser. Stellen Sie sicher, dass die Glasröhren absolut sauber sind.
- Ist dies nicht der Fall, tauchen Sie die Glaskapillaren zuerst in ein organisches Lösungsmittel (z. B. Ethanol) und dann in doppelt destilliertes Wasser. Kapillarenden mit einem Bunsenbrenner kurz erhitzen. Alternativ können Sie Glasröhren gewaschen und erhitzt direkt beim Hersteller bestellen (siehe Materialliste).
- Bei dualen somatodendritischen Aufzeichnungen ist darauf zu achten, dass der somatische Pipettenwiderstand zwischen 6 und 10 MΩ und bei dendritischen Pipetten zwischen 8 und 19 MΩ liegt, wenn sie mit intrazellulärer Lösung gefüllt sind (Tabelle 3). Standardisieren Sie den Pipettenwiderstand für zellgebundene Aufzeichnungen auf einen Widerstand von 10 MΩ, um vergleichbare Ergebnisse entlang der somatodendritischen Domäne des Neurons zu erzielen.
- Bereiten Sie frische Pipetten vor jeder Aufnahmesession (jeden Tag) oder unmittelbar vor dem Patchen vor und verwenden Sie sie 5 - 8 h nach ihrer Herstellung. Bewahren Sie die Pipetten in einem abgedeckten Glasbehälter auf, um sie vor Staub und Verstopfung der Spitze zu schützen.
- Polieren
- Prüfen und heisspolieren Sie jede Pipettenspitze mit einer Mikroschmiede, um eine bessere Abdichtung der Membran zu erzielen. Bevor Sie die Mikroschmiede verwenden, schmelzen Sie ein winziges Stück Glas auf dem Platin-Heizfaden. Ersetzen Sie diese Glasbeschichtung auf dem Platinfaden täglich, um die Beständigkeit zu gewährleisten (Peter Jonas, persönliche Mitteilung).
Anmerkung: Pipetten, die für an Zellen gebundene Aufzeichnungen verwendet werden, können vor dem Heißpolieren beschichtet werden, um Hintergrundgeräusche zu reduzieren. Zur Beschichtung der Pipetten kann ein Isoliermittel wie geschmolzenes Zahnwachs oder ein Silikonelastomer verwendet werden.
>3. Vorbereitung von Hirnschnitten
- Verwenden Sie gesunde Wistar-Ratten im Alter von 16 bis 19 Tagen. Verwenden Sie keine ungesunden Tiere oder Tiere, die an Unterkühlung oder Dehydrierung leiden. Bevor Sie mit der Vorbereitung der Scheiben beginnen, bewahren Sie das Tier an einem sicheren und ruhigen Ort auf. Vermeiden Sie es, andere Tiere im Raum zu haben, während Sie ein Tier vorbereiten. Behandle Tiere vorsichtig.
- Gießen Sie Saccharose-ACSF in zwei 400-ml-Becher aus Polypropylen (PP) und stellen Sie sie für 45 Minuten in den -80 °C-Gefrierschrank. Mischen Sie die Lösung, um eine homogene eiskalte Flüssigkeit/gefrorene Lösung zu erhalten, und stellen Sie die Becher auf Eis. Die Saccharose-ACSF-Lösung mit Hilfe einer Mikrofilterkerze (Ø 13 mm) in jedem PP-Becherglas mit Carbogengas zuführen.
- Bereiten Sie den Slicer und die Reservekammer vor
- Verwenden Sie einen hochwertigen Tissue-Slicer mit extrem geringen vertikalen Vibrationen, um die Beschädigung der oberflächlichen Schichten der Scheiben so gering wie möglich zu halten. Fixiere eine frische und ganze Rasierklinge auf dem Hobel.
- Verwenden Sie für jede Schneidesitzung eine neue Rasierklinge. Vermeiden Sie es, die Rasierklinge zu verbiegen. Entfernen Sie nicht den Fettfilm an der Oberfläche der Rasierklinge (Josef Bischofberger, persönliche Mitteilung).
- Falls vorhanden, überprüfen Sie die vertikale Vibration mit einer vom Hersteller bereitgestellten Vibrationssonde. Alternativ können Sie eine speziell angefertigte Vibrationssonde verwenden. Reduzieren Sie die vertikalen Vibrationen der Klinge, um so nah wie möglich an 0 μm heranzukommen.
- Bereiten Sie eine 150-ml-Reservekammer für Scheiben vor. Gießen Sie Standard-ACSF in die Reservekammer und legen Sie es in ein Wasserbad. Die Reservekammerlösung mit einer Mikrofilterkerze (Ø 6 mm) mit Carbogen versorgen. Achten Sie darauf, dass die Carbogen-Blasen so klein wie möglich sind.
Anmerkung: Bauen Sie alle 2 - 3 Monate eine neue Reservekammer, um die Schnittqualität konstant zu halten.
- Scheiben schneiden
- In einem stillen Raum, in dem der Versuchsleiter nicht gestört oder gestresst ist, wird das Tier mit einer Operationsschere (Länge 150 mm) auf Höhe des Gebärmutterhalsmarks enthauptet.
- Schneiden Sie mit einem Skalpell die Haut am Oberkopf des Tieres in nasaler bis kaudaler Richtung ein und entfernen Sie sie seitlich. Schneiden Sie mit einer feinen Schere die Schädeldecke vom kaudalen bis zum nasalen Teil des Kopfes ab und entfernen Sie beide Schädelteile seitlich. Entnehmen Sie das Gehirn mit einem dünnen Spatel und geben Sie es vorsichtig in ein PP-Becherglas mit eiskaltem (0 - 4 °C) Saccharose-ACSF, äquilibriert mit Carbogen.
Anmerkung: Diese Abfolge von Schritten muss so schnell wie möglich, aber auch akribisch (<<1 min, ca. 40 s) erfolgen.
- Halten Sie das Gehirn für ~2 bis 5 Minuten in der Lösung des PP-Bechers. Stellen Sie den Carbogen-Druck ein, um Gehirnbewegungen zu vermeiden. Wenn die Carbogenblasen zu groß sind, ersetze die Mikrofilterkerze durch eine frische.
- Legen Sie das Gehirn auf eine 9 cm große Petrischale, deren Innenseite mit einer ~0,5 cm dicken Sylgard-Schicht bedeckt ist. Bereiten Sie diese Petrischale im Voraus zu.
- Umgeben Sie das Gehirn mit eiskalter Saccharose-ACSF. Stellen Sie sicher, dass eine flüssige Phase der ACSF-Saccharoselösung das Gehirn untertaucht. Schneiden Sie bei koronalen Schnitten den vorderen Teil des Gehirns in der Kronenebene mit einem Skalpell oder einer Rasierklinge ab. Entfernen Sie das Kleinhirn mit einem koronalen Schnitt.
- Tragen Sie Cyanacrylatkleber auf das Probentablett auf (Bereich ~1 cm2). Füge den Hirnblock so ein, dass der vordere Teil zum Schneiden zeigt. Saccharose-ACSF vorsichtig mit der großen Öffnung einer Pasteur-Glaspipette auf das geklebte Gehirn tropfen lassen und anschließend langsam die Schneidkammer des Slicers eintauchen. Manövrieren Sie die Probenschale so, dass die Schnittfläche (d. h. das erste Gewebe, das auf die Klinge trifft) die ventrale Oberfläche des Gehirns ist.
- Carbogen mit einer Mikrofilterkerze aus gebogenem Glas (Ø 6 mm) auf die Schneidkammer auftragen (optional).
- Stellen Sie die Rasierklinge in einem Winkel von ~15° in Bezug auf die horizontale Ebene ein. Schneiden Sie koronale Hirnschnitte von ~500 μm in kaudaler bis nasaler Richtung, bevor Sie die Substantia nigra erreichen. Verringern Sie die Dicke, um 300 - 350 μm dicke Scheiben zu schneiden, die den interessierenden Bereich enthalten.
- Trennen Sie die Scheiben vom Gewebeblock mit einer sehr dünnen Perfusionsnadel, die an einer Spritze parallel zum Rand der Rasierklinge befestigt ist. Biegen Sie die Nadel so, dass zwischen Nadel und Spritze ein Winkel von 90° entsteht. Stellen Sie sicher, dass kein Druck auf die Rasierklinge ausgeübt wird, während Sie die Scheibe aus dem Gewebeblock entfernen.
- Speichern von Scheiben
- Übertragen Sie die Scheiben mit der größten Öffnung einer Pasteurpipette aus Glas (die an einem Kolben befestigt ist) in die Reservekammer. Sobald alle Scheiben in die Reservekammer (Christoph Schmidt-Hieber, persönliche Mitteilung) überführt sind, bringen Sie die Temperatur des Wasserbades für 0,5 - 1 h auf 34 °C.
- Schalten Sie nach dieser Zeit das Wasserbad aus und bewahren Sie die Scheiben bei Raumtemperatur auf. Stellen Sie den Carbogen-Druck ein, um Bewegungen der Scheiben in der Reservekammer zu vermeiden. Bewahren Sie die Scheiben weitere 10 bis 20 Minuten auf, bevor Sie mit den Aufnahmen beginnen.
- Reinigen Sie das Gerät und die Mikrofilterkerzen am Ende des Schneidevorgangs vorsichtig, aber gründlich mit doppelt destilliertem Wasser.
>4. Duale somatische und somatodendrische Aufzeichnungen in nigralen Neuronen und Biocytin-Feilung
- Befolgen Sie die Beschreibungen für den Zusammenbau eines Patch-Clamp-Setups für Slices in The Axon Guide.
- Aufnahmekammer vorbereiten
- Geben Sie 1 - 2 mL doppelt destilliertes Wasser in die Aufnahmekammer. Vergewissern Sie sich, dass es nicht undicht ist. Stellen Sie die Aufnahmekammer auf den verschiebbaren x-y-Tisch.
- Führen Sie den Standard-ACSF durch ein sauerstoffundurchlässiges Perfusionsschlauchsystem (Polytetrafluorethylen) in die Aufnahmekammer ein. Stabilisieren Sie den Perfusionsfluss in der Kammer mit einer Rate von 4 - 5 mL min-1. Halten Sie die Länge des Schlauchs, der das Becherglas mit ACSF und die Aufzeichnungskammer verbindet, so kurz wie möglich (1 m).
- Wählen Sie eine Gehirnscheibe aus der Reservekammer aus und übertragen Sie sie mit der größten Öffnung einer Pasteur-Glaspipette in die Aufnahmekammer. Decken Sie die Scheibe mit einem Platinring ab, um sie am Boden der Aufnahmekammer zu verankern. Verwenden Sie einen flachen Platinring (Ø 1,5 cm) und kleben Sie parallele Nylonfäden (Abstand >2 mm) darauf.
- Optik anpassen und optimieren
- Visualisieren Sie die Schichten mit Hilfe der Infrarot-Videomikroskopie (IR). Stellen Sie die Köhler-Beleuchtung 51 ein und optimieren Sie die Optik des differentiellen Interferenzkontrasts (DIC) oder der Schrägausleuchtung (Dodt Gradient Contrast - DGC).
- Überprüfen Sie die Qualität der Scheibe. Behalten Sie nur Scheiben mit glatten und ebenen Oberflächen, die nicht zu stark kontrastiert sind und nur kleine, verstreute Krater aufweisen.
- Füllen Sie 2 frische und unbenutzte Patch-Pipetten mit intrazellulärer Lösung (Tabelle 3). Verwenden Sie ein 0,5-ml-Röhrchen mit der Pipettenlösung, um die Spitze der Pipette durch Kapillarwirkung zu füllen. Um das Befüllen der Spitze von Pipetten ohne Filament zu beschleunigen, üben Sie mit einem Schlauch, der an einer Spritze befestigt ist, Unterdruck auf das Ende der Pipette aus.
- Positionieren Sie die Pipetten über der Oberfläche der Scheibe
- Überprüfen Sie, ob die Silberdrähte mit Chlorid überzogen sind.
- Führen Sie die Pipetten nacheinander in die Pipettenhalter ein und üben Sie einen Überdruck (~70 mbar) über einen Schlauchkreislauf aus, der den Pipettenhalter, einen Dreiwegehahn und ein Manometer verbindet. Senken Sie die Pipette in das Bad der Aufnahmekammer.
- Prüfen Sie, ob der Druckwert am Manometer für ~1 - 2 min konstant ist. Wenn der Druck abnimmt, überprüfen Sie den Schlauch oder die Dichtungs-O-Ringe im Inneren des Pipettenhalters.
- Platzieren Sie die Pipettenspitze in der Mitte des Videomonitors und stellen Sie sicher, dass sie nicht verstopft ist. Stellen Sie sicher, dass sich die Pipettenspitze nicht bewegt, wenn Sie Druck auf die Pipette ausüben oder ablassen.
- Überprüfen Sie die Pipettenspitze auf Drift und Vibrationen, indem Sie ein kleines Kreuz in der Mitte des Monitors genau an der Position der Pipettenspitze zeichnen und beobachten Sie 5 Minuten lang mögliche Bewegungen der Spitze.
- Legen Sie einen Spannungsschritt (5 mV) an, um den Pipettenwiderstand an einem Oszilloskop zu überwachen. Stellen Sie das Haltepotenzial des Patch-Clamp-Verstärkers auf 0 mV ein. Heben Sie das Pipetten-Offset-Potential so ab, dass der Gleichstrom-Pipettenstrom am Verstärkermessgerät Null anzeigt.
- Bewegen Sie die Pipetten nach unten zur Scheibe und halten Sie sie über der Oberfläche.
- Wählen Sie ein Neuron mit langen Dendriten aus und patchen Sie es
- Innerhalb der Substantia nigra wählt man ein gesundes Neuron mit langen Dendriten aus, das über eine lange Strecke in ungefähr der gleichen Ebene (Abbildung 1A und 1B) mit IR-Dodt Gradient Contrast (IR-DGC) verfolgt werden kann. Wählen Sie einen glatten und homogenen Zellkörper. Vermeiden Sie die beiden stark kontrastierenden Zellen an der Oberfläche der Scheibe (Abbildung 1C und 1D), da es schwierig ist, einzubrechen und stabile Aufzeichnungsbedingungen über die Zeit zu erhalten (stabiler Serienwiderstand). Wählen Sie Neuronen aus, die ihr Soma 10 - 30 μm unter der Schnittoberfläche haben.
- Bewegen Sie die somatische Elektrode in der Nähe des Somas (40 - 50 μm Entfernung) und die dendritische Elektrode in der Nähe des Dendriten im gleichen Abstand. Verwenden Sie eine 2-fache Vergrößerung (vierfacher Wechsler), um einen Teil eines Dendriten auszuwählen und zu patchen. Erzielen Sie auf dem Monitor eine absolute Vergrößerung von 2.100X ohne Vergrößerung (1X) und von 5.500X mit einer 2-fachen Vergrößerung.
- Lassen Sie den Druck der somatischen Pipette leicht um 10 mbar locker. Regulieren Sie bei Bedarf den dendritischen und somatischen Pipettendruck, um eine Verschiebung der Zellstruktur (Soma und Dendriten) innerhalb der Scheibe zu vermeiden.
- Positionieren Sie die dendritische Pipette nahe an der Membran, um ein kleines Grübchen zu sehen. Lassen Sie den Druck auf die Pipettenspitze los und flicken Sie den Dendriten, während Sie den Pipettenwiderstand kontrollieren. Im Idealfall reicht schon ein sehr geringer Sog aus, um eine gute Abdichtung zu erhalten.
- Reduzieren Sie die Amplitude der Kapazitätstransienten der Pipette über dem Stromschritt so weit wie möglich, indem Sie einen Spannungsimpuls mit hoher Verstärkung und geringer Filterung 51 und das Oszilloskop verwenden. Wechseln Sie mit der dendritischen Pipette in den Ganzzellmodus.