Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.
>1. Elektrophysiologische Aufzeichnungen zur Untersuchung spontaner und elektrodenstimulationsabhängiger Aktivität
- Waschen Sie die Multielektrodenarray-Kultur (MEA) mit extrazellulärer Lösung bei Raumtemperatur (RT).
- Trocknen Sie die Kontakte mit einem Taschentuch und montieren Sie die MEA auf dem MEA-Setup.
Anmerkung: Um die Kultur während des Einbettens feucht zu halten, geben Sie einen kleinen Tropfen extrazelluläre Lösung in die Kultur.
- Fügen Sie 300 μl extrazelluläre Lösung hinzu und warten Sie 10 Minuten vor der Aufnahme, damit sich das System stabilisieren kann.
- Zeichnen Sie die spontane Aktivität 2 Minuten lang von allen Elektroden auf, indem Sie auf die Aufnahme-/Erfassungstaste der Software drücken und die Aufnahmeelektroden identifizieren.
- MEA-Elektrodenstimulation: Wählen Sie die Amplitude/Dauer/Form des Stimulus in der entsprechenden Software aus und wenden Sie ihn nacheinander auf mehrere Elektroden an. Wählen Sie die Elektroden anhand derjenigen aus, die eine spontane Aktivität zeigen (wie in Schritt 1.4). Von allen verbleibenden Elektroden aufnehmen.
- Um Stimulationsartefakte auszuschließen, stimulieren Sie 10 Mal mit derselben Elektrode. Wenn die Kultur mindestens 8 von 10 Mal reagiert, kann dies als positive Reaktion auf elektrodeninduzierte Stimulation angenommen werden.
- Um Hintergrundrauschen zu identifizieren, geben Sie Tetrodotoxin (TTX) in einer Konzentration von 1 μM auf die Kultur, um spannungsgesteuerte Natriumkanäle zu blockieren, und zeichnen Sie 2 Minuten lang auf. Verwenden Sie diese Option, um die Spike-Detektion (2.1 und 2.2) durchzuführen.
>2. Datenanalyse
- Ermitteln Sie mit der entsprechenden Software die spontane Aktivität für jede Elektrode unter Verwendung eines Detektors auf der Grundlage von Standardabweichungen und einem nachfolgenden Diskriminator. Die Aktivität wird als schnelle Spannungstransienten (<5 ms) angezeigt.
- Wählen Sie einen Schwellenwert, der bei der Analyse der TTX-behandelten Proben zu keiner Aktivität führt. Passen Sie den Schwellenwert für jedes Experiment an, um zwischen falsch positiven und falsch negativen Erkennungen zu unterscheiden.
- Beobachten Sie mit geeigneter Software die detektierte neuronale Aktivität jeder Elektrode als Rasterdiagramm nach Standardverfahren (siehe Abbildung 1A-C).
- Ermitteln und zeigen Sie die gesamte Netzwerkaktivität an, indem Sie alle erkannten Ereignisse innerhalb eines gleitenden Fensters von 10 ms summieren, das um 1 ms Schritt verschoben ist.
- Erkennen Sie stimulationsinduzierte Aktivität, indem Sie die Rohdaten mit geeigneter Analysesoftware anzeigen. Identifizieren Sie die einzelnen Spikes manuell offline. Einzelne Spitzen erscheinen als schnelle Spannungstransienten, die nach dem Stimulationsartefakt auftreten (Pfeilspitze in Abbildung 1E). Ein Beispiel ist in Abbildung 1E dargestellt.
- Analysieren Sie je nach Experiment die Anzahl der ansprechenden Elektroden, den Schwellenwert, der zum Erreichen einer Reaktion erforderlich ist, die Anzahl des Aktionspotentials pro Elektrode und andere interessante Parameter.
