Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
HINWEIS: Jeder Teilnehmer, der an dem Eingriff beteiligt ist, muss ordnungsgemäß in grundlegenden chirurgischen Verfahren geschult sein und eine gültige Lizenz für die Durchführung von Tierversuchen haben.
>1. Anästhesie und Prämedikation
- Betäuben Sie eine Ratte mit intraperitonealen Injektionen von Natrium-Pentobarbital (eine Anfangsdosis von 60 mg·kg-1 für 6 Monate alte männliche Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 400 bis 550 g).
Anmerkung: Dieses Protokoll ist nicht auf den angegebenen Stamm, das angegebene Geschlecht oder das Alter der Ratten beschränkt. Auch alternative Anästhesiemittel wie Ketamin-Xylazin-Mix, Alpha-Chloralose oder Fentanyl + Midazolam + Medetomidin können verwendet werden, wenn sie für andere Forschungsziele besser geeignet sind oder wenn dies von der Ethikkommission verlangt wird.
- Überprüfen Sie nach ca. 5 Minuten die Narkosetiefe, indem Sie die Zehen der hinteren Gliedmaßen der Ratte mit einer stumpfen Zange einklemmen. Fahren Sie nur dann mit den nächsten Schritten des Protokolls fort, wenn keine Reflexwirkung beobachtet wird.
- Injizieren Sie 0,05 ml Atropin subkutan, um die Schleimproduktion nach der Intubation zu reduzieren.
- Injizieren Sie subkutan 5 ml Phosphatpuffer mit 4% iger Glukoselösung, NaHCO3 (1 %) und Gelatine (14 %). Dieser Puffer wird während eines Experiments von den Hautgefäßen absorbiert und trägt zur Aufrechterhaltung des Flüssigkeitshaushalts bei.
- Während der gesamten Operation ist das Tier regelmäßig auf Reflexwirkungen zu untersuchen und bei Bedarf eine zusätzliche Anästhesie durchzuführen (10 mg·kg-1·h-1 Natrium-Pentobarbital).
>2. Chirurgie
- Bereiten Sie das Tier auf die chirurgische Behandlung vor, indem Sie das Fell über den dorsalen Teil der linken Hintergliedmaße, vom Knöchel bis zur Hüfte, den Rücken, vom Schwanz bis zu den hohen Thoraxsegmenten (Th), die linke Seite der Brust und die ventrale Seite des Halsbereichs über dem Brustbein rasieren
- Platzierung des intravenösen Zugangs
- Legen Sie die Ratte auf den Rücken auf ein Heizkissen mit geschlossenem Kreislauf (und befestigen Sie es mit Gliedmaßenfixierungen).
- Machen Sie mit einer 21er Klinge einen Längsschnitt durch die Haut vom Brustbein bis zum Kinn.
- Halten Sie die Haut mit einer Pinzette fest und trennen Sie sie vom darunterliegenden Gewebe.
- Legen Sie mit stumpfen Dissektionstechniken die rechte Halsvene frei. Präparieren Sie die Vene vorsichtig vom umgebenden Gewebe.
- Lokalisieren Sie den Teil der Vene ohne Verzweigungspunkte und schieben Sie zwei 4-0-Ligaturen darunter.
- Machen Sie einen losen Knoten am proximalen Ende des zuvor identifizierten nicht verzweigten Segments der Vene und einen losen Knoten am distalen Ende dieses Venensegments. Klemmen Sie die Vene proximal zum Herzen und ligieren Sie dann den distalen Teil der Vene.
- Machen Sie mit einer Irisschere einen Schnitt zwischen der Klemme und der entfernten Ligatur. Halten Sie einen Lappen der Vene fest und führen Sie einen vorgefüllten Katheter bis zu der Stelle ein, an der er durch die Klemme blockiert ist.
- Während Sie die Vene und den Katheter mit einer Pinzette zusammenhalten, entfernen Sie die Klemme und schieben Sie den Katheter einige Millimeter in die Vene. Befestigen Sie beide Enden des Katheters an der Vene und fügen Sie einen zusätzlichen Fixierungspunkt an der Haut hinzu.
>3. Einführung des Trachealtubus
- Trennen Sie mit einer stumpfen Pinzette die beiden Unterkieferdrüsen, die die Muskeln sternohyoideus bedecken. Trennen Sie die Sternohyoideus-Muskeln an der Mittellinie, um die Luftröhre freizulegen.
- Schieben Sie drei 4-0-Ligaturen unter die Luftröhre und machen Sie dann zwei Knoten unter dem Einführpunkt des Trachealtubus und einen Knoten darüber.
- Lokalisieren Sie den krikoiden Knorpel des Kehlkopfes und machen Sie einen Schnitt unterhalb des dritten Trachealknorpels.
- Führen Sie einen Trachealtubus in die Luftröhre ein und befestigen Sie den Schlauch mit vorbereiteten Ligaturen, dann fügen Sie der Haut eine zusätzliche Ligatur hinzu.
- Legen Sie ein kleines Stück Watte über die abgetrennten Muskeln und nähen Sie die Haut über die operierte Stelle.
>4. Dissektion der Nerven der hinteren Gliedmaßen
- Führen Sie mit einer 21er Klinge einen Längsschnitt an der hinteren Seite der linken hinteren Gliedmaße von der Achillessehne bis zur Hüfte durch.
- Fassen Sie die Haut mit einer Pinzette und trennen Sie sie mit stumpfen Präpariertechniken von den darunter liegenden Muskeln auf beiden Seiten des Schnitts.
- Lokalisieren Sie die Kniekehle an der Rückseite des Kniegelenks, die vom Musculus biceps femoris bedeckt ist, und machen Sie mit einer Schere einen Schnitt zwischen dem vorderen und hinteren Teil dieses Muskels.
- Bewegen Sie sich nach oben und schneiden Sie zwei Köpfe des Bizeps femoris bis zur Hüfte ab, um den Ischiasnerv freizulegen. Nach Bedarf kauterisieren, um Blutungen zu vermeiden.
- Identifizieren Sie die uralen, tibialen und gemeinsamen Peronealäste des Ischiasnervs.
- Trennen Sie mit einer Schere den lateralen vom medialen Kopf des Musculus gastrocnemius, um den Nervus tibialis und seine Äste freizulegen.
Fassen Sie - mit 55 Pinzetten das distale Ende des Nervus sural, schneiden Sie es distal ab und präparieren Sie es so weit wie möglich.
- Wiederholen Sie den Vorgang mit dem Nervus peroneus communis.
- Trennen Sie den Nervus tibialis mit einem stumpfen Glasstab vom umgebenden Gewebe, achten Sie darauf, die Blutgefäße nicht zu beschädigen, und schneiden Sie ihn distal durch.
- Identifizieren Sie den medialen Gastrocnemius (MG) und den Nervus gastrocnemius und soleus lateralis (LGS).
- Präparieren Sie mit 55 Pinzetten vorsichtig die Nerven MG und LGS, trennen Sie sie vom umgebenden Gewebe, behalten aber ihre Verbindung zu den jeweiligen Muskeln bei.
- Legen Sie ein mit Kochsalzlösung getränktes Stück Watte unter die freiliegenden Nerven.
- Schließen Sie die Haut über dem operierten Bereich.
>5. Laminektomie
- Machen Sie mit einer 21er Klinge einen Längsschnitt vom Kreuzbein bis zu den Brustwirbeln.
- Trennen Sie die Haut von den darunter liegenden Muskeln.
- Den Musculus longissimus auf beiden Seiten des thorakalen und lumbalen Dornfortsatzes durchtrennen.
- Ziehen Sie mit einem stumpfen Skalpell die Muskeln aus der Wirbelsäule zurück, um die Querfortsätze jedes Wirbels freizulegen.
- Schneiden Sie mit einer stumpfen Schere die Sehnen der Muskeln durch, die mit den Querfortsätzen entlang der freiliegenden Wirbelsäule verbunden sind. Bei Bedarf Blutstillungsmittel anwenden.
- Identifizieren Sie den Th13-Wirbel als unterstes Brustsegment mit Rippenansatz und entfernen Sie mit feinen Rongeuren Dornfortsätze und Laminae von Th13- bis L2-Wirbeln, um die Lendenwirbelsegmente des Rückenmarks freizulegen. Denken Sie daran, den L3-Dornfortsatz nicht zu beschädigen, der als Fixierungspunkt für die Stabilisierung der Wirbelsäule verwendet wird.
- Entfernen Sie den Dornfortsatz Th12 und glätten Sie die Rückenfläche des Wirbels so weit wie möglich.
- Trennen Sie die Muskeln mit stumpfen Präpariertechniken vom Th11-Wirbel, um Einführpunkte für den Halter zu schaffen.
- Lege dünne, mit Kochsalzlösung getränkte Watte über die freiliegenden Segmente des Rückenmarks.
- Bewegen Sie die Ratte auf den maßgefertigten Metallrahmen mit zwei parallelen Stangen und zwei verstellbaren Armen mit Klammern zur Unterstützung und Stabilisierung der Wirbelsäule.
>6. Vorbereitung auf die Aufnahme und Stimulation
- Fixation der Wirbelsäule und Nervenanordnung
- Setzen Sie die Ratte in den maßgefertigten Rahmen auf ein Heizkissen, das mit dem geschlossenen Heizsystem verbunden ist, um die Körpertemperatur des Tieres auf 37 ± 1 °C zu halten.
- Führen Sie Elektrokardiogramm-Elektroden (EKG) unter die Haut ein und schließen Sie sie an einen Verstärker zur Herzfrequenzüberwachung an.
- Bilden Sie mit den Hautlappen einen tiefen Pool über dem freiliegenden Rückenmark.
- Fixieren Sie die Wirbelsäule mit Metallklammern, indem Sie Klammern unterhalb der Querfortsätze Th12 und bei L3 Dornfortsatz anbringen.
- Achten Sie darauf, dass die Wirbelsäule gesichert und horizontal angeordnet ist, und üben Sie dann dorso-ventralen Druck auf beide Seiten der Säule aus, um die Muskeln zurückzuziehen.
- Füllen Sie den Pool mit warmem (37 °C) Mineralöl und halten Sie ihn auf dieser Temperatur.
- Fädeln Sie eine 4-0 Ligatur durch die Achillessehne, heben und strecken Sie die operierte linke Hintergliedmaße, so dass das Sprunggelenk auf Höhe der Hüfte ist.
- Machen Sie mit den Hautlappen einen tiefen Pool über den freiliegenden Tibia-, MG- und LGS-Nerven.
- Füllen Sie den Pool mit warmem (37 °C) Mineralöl.
- Platzieren Sie MG- und LGS-Nerven auf bipolaren Stimulationselektroden aus Silberdraht und verbinden Sie sie mit einem Rechteckpulsstimulator. Verwenden Sie für jeden Nerv separate Stimulationskanäle.
>7. Platzierung der Oberflächenelektrode
- Platzieren Sie eine silberne Kugelelektrode auf der linken kaudalen Seite des freiliegenden Rückenmarks, wobei eine Referenzelektrode in die Rückenmuskulatur eingeführt wird, und verbinden Sie beide Elektroden mit dem Differenz-DC-Verstärker. Die Oberflächenkugelelektrode wird verwendet, um afferente Volleys von Nerven aufzunehmen.
- Stimulieren Sie mit einem Konstantstromstimulator die MG- und LGS-Nerven mit Rechteckimpulsen von 0,1 ms Dauer, die mit einer Frequenz von 3 Hz wiederholt werden, und beobachten Sie afferente Salven.
- Bestimmen Sie die Schwelle (T) für die Nervenaktivierung, stimulieren Sie jeden Nerv mit einer Intensität von etwa 3·T und zeichnen Sie die Amplitude der afferenten Salve für jeden Nerv auf.
- Bewegen Sie die Oberflächenelektrode rostral und wiederholen Sie den Vorgang, um Wirbelsäulensegmente zu identifizieren, bei denen die Amplituden der Volleys für jeden Nerv am höchsten sind. Nachdem Sie die maximale Position der Salve bestimmt haben, bewegen Sie die Oberflächenelektrode in einen sicheren Abstand zum Rückenmark.
- Muskellähmung und Bildung eines Pneumothorax, um die Atembewegungen zu reduzieren
- Lähmen Sie die Ratte intravenös mit einem neuromuskulären Blocker und schließen Sie den Trachealtubus an ein externes Beatmungsgerät an, das mit einem nagetierkompatiblen Kapnometer übereinstimmt (Pancuroniumbromid, in einer Anfangsdosis von 0,4 mg-kg-1, ergänzt alle 30 Minuten in Dosen von 0,2 mg-kg-1)
- Überwachen Sie die endtidale CO2 -Konzentration und halten Sie sie bei etwa 3 bis 4 %, indem Sie die Beatmungsparameter (Frequenz, Luftdruck und Durchflussmengen) anpassen.
- Machen Sie einen Längsschnitt in der Haut zwischen der 5. und 6. Rippe an der Seite der Aufnahme.
- Schneiden Sie mit einer Schere mit stumpfer Spitze die darüber liegenden Muskeln ab, um den Interkostalraum zwischen den Rippen sichtbar zu machen.
- Machen Sie mit einer kleinen, scharfen Schere einen kleinen Schnitt in die Interkostalmuskulatur und in das Brustfell und führen Sie dann die Spitze einer stumpfen Pinzette in die Öffnung ein, wobei Sie darauf achten, dass sie nicht auf die Lunge drücken.
- Lassen Sie die Pinzette ausdehnen oder führen Sie ein kleines Röhrchen ein, um den Pneumothorax während des gesamten Experiments offen zu halten.
- Überwachen Sie nach der neuromuskulären Blockade die Narkosetiefe, indem Sie die EKG-Frequenz überprüfen und das Anästhetikum ergänzen, wenn die Herzfrequenz 400 Schläge pro Minute überschreitet. Muskellähmung und Bildung eines Pneumothorax, um die Atembewegungen zu reduzieren, was die Aufnahmestabilität verbessert.
>8. Öffnen der Dura und Pia Mater
- Heben Sie mit der Pinzette #55 die Dura mater vorsichtig an und schneiden Sie sie kaudal vom L5-Segment rostral bis zum L4-Segment.
- Machen Sie mit einer ultradünnen 5SF-Pinzette einen kleinen Fleck in der Pia, der die dorsale Säule zwischen den Blutgefäßen bedeckt, genau auf der Höhe der maximalen afferenten Salve des MG- oder des LGS-Nervs.
- Verwenden Sie bei Bedarf kleine Stücke mit Kochsalzlösung getränkten und getrockneten Gelschaums, um Blutungen zu blockieren.
>9. Elektrodenplatzierung der transspinalen Gleichstromstimulation (tsDCS)
- Machen Sie einen kleinen Hautschnitt auf der ventralen Seite des Bauches einer Ratte auf rostrocaudaler Ebene, der der Position der lumbalen (L)4-L5 Wirbelsäulensegmente entspricht.
- Fassen Sie den freiliegenden Hautlappen mit einem Metallclip an, der als Referenzelektrode dient.
- Lege einen mit Kochsalzlösung getränkten Schwamm auf die dorsale Seite des Brustwirbels (Th) 12. Stellen Sie sicher, dass die Schwammgröße der einer aktiven tsDCS-Elektrode (kreisförmige Edelstahlplatte mit einem Durchmesser von 5 mm) entspricht.
- Drücken Sie den Schwamm mit einer aktiven tsDCS-Elektrode mit einem feinen Manipulator auf den Knochen und achten Sie darauf, dass die gesamte Oberfläche der Elektrode gleichmäßig angedrückt wird.
- Verbinden Sie Referenz- und aktive tsDCS-Elektroden mit einer Konstantstrom-Stimulatoreinheit, die einen kontinuierlichen Gleichstromfluss liefern kann.
>10. Vorbereitung von Mikropipetten
- Bereiten Sie mit einem Mikroelektrodenabzieher eine Mikroelektrode vor.
Anmerkung: Es können sowohl Filament- als auch Nicht-Filament-Elektroden verwendet werden. Denken Sie jedoch daran, dass der Schaft der Elektrode lang genug sein muss, um das Bauchhorn zu erreichen, und gleichzeitig dünn genug, um das Rückenmark beim Abstieg nicht zu komprimieren.
- Stellen Sie die Abziehereinstellung so ein, dass der Schaft, der in das Rückenmark eintritt, etwa 3 mm lang ist, während die Spitze der Elektrode einen Durchmesser von nicht mehr als 1 bis 20122 μm hat und der Mikroelektrodenwiderstand zwischen 10 und 20 MΩ liegt.
- Füllen Sie die Mikroelektroden mit 2M Kaliumcitrat-Elektrolyt.
- Montieren Sie die vorbereitete Mikroelektrode auf dem Mikromanipulator, so dass eine Schrittbewegung von 1 bis 2 μm und eine stereotaktische Kalibrierung möglich sind.
- Verbinden Sie die Mikroelektrode mit dem intrazellulären Verstärker, wobei die Referenzelektrode in der Rückenmuskulatur platziert wird.
- Überwachen Sie nach der neuromuskulären Blockade die Narkosetiefe, indem Sie die Häufigkeit des Elektrokardiogramms (EKG) überprüfen und das Anästhetikum so ergänzen, dass die Herzfrequenz der Ratte 400 Schläge pro Minute nicht überschreitet.
>11. Verfolgung und Penetration von Motoneuronen
- Platzieren Sie die afferente Volley-Aufzeichnungselektrode wieder auf der dorsalen Oberfläche des Rückenmarks, kaudal zur Position der Aufzeichnungsstelle, auf Höhe des L6-Segments.
- Stimulieren Sie den medialen Gastrocnemius (MG) und den Nervus gastrocnemius und soleus lateralis (LGS) mit elektrischen Impulsen von 0,1 ms bei einer Frequenz von 3 Hz und einer Intensität von 3T, um alle Axone von Alpha-Motoneuronen innerhalb eines ausgewählten Nervs zu aktivieren.
- Treiben Sie die Mikropipette in ein ausgewähltes Pflaster in der Pia mit einem mediolateralen Winkel von 15\u201220° (mit einer seitlich gerichteten Spitze).
- Nach dem Abtauchen unter die Oberfläche kalibrieren Sie die Mikroelektrode und kompensieren ihre Kapazität und ihren Spannungsversatz und setzen Sie die Durchdringung des Rückenmarks fort, wenn alle Parameter stabil sind. Ein antidromisches Feldpotential des Motoneuronenpools wird an der Mikroelektrodenspannungskurve sichtbar sein, während man sich während der Stimulation des jeweiligen Nervs einem dedizierten motorischen Kern nähert.
- Fahren Sie mit der Penetration mit der Mikroelektrode in Schritten von 1 bis 20122 μm fort und verwenden Sie in regelmäßigen Abständen die Buzz-Funktion des intrazellulären Verstärkers, um die Elektrodenspitze von Rückständen zu befreien.
- Beobachten Sie die Motoneuronenpenetration, die durch eine plötzliche Hyperpolarisation der aufgezeichneten Spannungsspur und das Auftreten eines antidromischen Spike-Potentials gekennzeichnet ist.
>12. Aufzeichnung der Membran- und Feuereigenschaften von Motoneuronen
- In einem Brückenmodus des intrazellulären Verstärkers wird das Motoneuron anhand des "Alles-oder-Nichts"-Auftretens des antidromischen Aktionspotentials durch Stimulation der entsprechenden Nervenäste identifiziert. Zeichnen Sie 20 nachfolgende Ablaufverfolgungen für die spätere Mittelwertbildung auf.
- Implementierung eines strengen Einschlusskriteriums, um qualitativ hochwertige Daten zu gewährleisten: Ruhemembranpotential mit einer Amplitude von mindestens -50 mV; Aktionspotentialamplituden von mehr als 50 mV mit positivem Überschwingen; Membranpotential, das vor der Aufzeichnung mindestens 5 Minuten lang stabil ist.
- In einem diskontinuierlichen Strom-Clamp-Modus (Stromschaltratenmodus 4–8 kHz) des intrazellulären Verstärkers wird in einem Motoneuron ein orthodromisches Aktionspotential mit 0,5 ms intrazellulären depolarisierenden Stromimpulsen evoziert. Wiederholen Sie den Vorgang mindestens 20 Mal für die Offline-Mittelwertbildung.
- Stimulieren Sie ein Motoneuron mit 40 kurzen Impulsen (100 ms) Hyperpolarisationsstrom (1 nA), um den Eingangswiderstand der Zelle zu berechnen.
- Stimulieren Sie ein Motoneuron mit 50 ms Rechteckimpulsen bei zunehmender Amplitude, um den Rheobase-Wert als minimale Amplitude des depolarisierenden Stroms zu bestimmen, der erforderlich ist, um einen einzelnen Spike hervorzurufen.
- Injizieren Sie 500 ms Rechteckimpulse mit depolarisierendem Strom bei steigenden Amplituden in Schritten von 0,1–2 nA, um rhythmische Entladungen von Motoneuronen hervorzurufen.
13. Transspinale Gleichstromstimulation (tsDCS)
- Unter Beibehaltung einer stabilen Penetration des Motoneurons wird der Polarisationsvorgang durch transspinale Anwendung von Gleichstrom gestartet. Passen Sie die Stromstärke und die Anwendungszeit an das Versuchsdesign an (z. B. 0,1 mA für 15 min).
- Beobachten Sie unmittelbar nach dem Einschalten des DC das Motoneuron-Membranpotential. Die anodale Polarisation (die aktive Elektrode als Anode) sollte zu einer Depolarisation des Membranpotentials führen, während die kathodale Polarisation (die aktive Elektrode als Kathode) einen gegenteiligen Effekt hervorrufen sollte. Beobachten Sie, ob eine Änderung des Ruhemembranpotentials als Reaktion auf die DC-Stimulation konstant ist, was sicherstellt, dass die Intensität des elektrischen Feldes nicht beeinflusst wird.
- Wiederholen Sie bei Dauerstromanwendung die Schritte 5.3 bis 5.6 in 5-Minuten-Intervallen.
- Schalten Sie den DC aus und wiederholen Sie die Schritte 5.3 bis 6 in 5-Minuten-Intervallen, bis die Aufzeichnungen instabil werden oder die Einschlusskriterien beeinträchtigt werden.
- Beenden Sie den Versuch und euthanasieren Sie das Tier durch intravenöse Verabreichung einer tödlichen Dosis Pentobarbital-Natrium (180 mg,kg-1).
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