Anlegen von Rauschströmen an Neuronen des medialen vestibulären Kerns mit der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik

Zusammenfassung

Quelle: Stefani, S. P., et al. Stochastische Rauschanwendung zur Beurteilung der Empfindlichkeit von Neuronen des medialen vestibulären Kerns in vitro. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video demonstriert ein Protokoll, das die Anwendung von unterschwelligen Rauschströmen auf mediale vestibuläre Kernneuronen unter Verwendung der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik beinhaltet, um den Einfluss der Geräuschströme auf die neuronale Empfindlichkeit gegenüber elektrischen Reizen zu untersuchen.

Protokoll

Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

>1. Tiere

HINWEIS: Die Mäuse wurden vom Australian Nagetier Centre (ARC; Perth, Australien) und fand in der Medical Foundation Building Animal Facility an der University of Sydney statt.

1. Halten Sie die Mäuse in einem standardmäßigen 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit Umgebungsanreicherung.
2. Verwenden Sie für alle Experimente männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse (3–5 Wochen alt).

>2. Vorbereitung von Lösungen

1. Bereiten Sie 1 l künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) vor, bestehend aus 29 mM NaHCO₃, 11 mM Glucose, 120 mM NaCl, 3,3 mM KCl, 1,4 mM NaH₂PO₄, 2,2 mM MgCl₂, 2,77 mM CaCl₂.
2. Bereiten Sie 200 ml Saccharose-ACSF (sACSF) vor, die 29 mM NaHCO₃, 11 mM Glukose, 241,5 mM Saccharose, 3,3 mM KCl, 1,4 mM NaH₂PO₄, 2,2 mM MgCl₂, 2,77 mM CaCl₂ enthalten. Vor der Zugabe von CaCl₂ zu ACSF und sACSF sind die Lösungen mit Carbogen (95 %_O2 und 5 % CO₂) zu begasen, um einen pH-Wert von 7,4 herzustellen und Kalkfällungen (Trübungen zu vermeiden).
3. Bereiten Sie eine intrazelluläre Lösung auf K⁺-Basis vor, die aus 70 mM Kaliumgluconat, 70 mM KCl, 2 mM NaCl, 10 mM HEPES, 4 mM EGTA, 4 mM Mg_2-ATP, 0,3 mM Na 3-GTP besteht, mit einem endgültigen pH-Wert von 7,3 (eingestellt mit KOH).
   Anmerkung: Es wird empfohlen, intrazelluläre Lösungen mit 0,22-μm-Filtern zu filtrieren und in 0,5-ml-Aliquoten bei -20 °C zu lagern.

>3. Präparation des Hirnstamms

1. Vor der Hirnstammextraktion den sACSF mit Carbogen äquilibrieren und 25 min bei -80 °C abkühlen lassen, um eine Eisaufschlämmung zu bilden.
2. Betäuben Sie die Maus mit sauerstoffgesättigtem Isofluran (3–5 %) (3 ml/min). Sobald die Reflexe der Hinterpfoten fehlen, enthaupten Sie die Maus mit einer scharfen Edelstahlschere.
3. Lege den Schädel frei, indem du mit einer Rasierklinge (#22 abgerundet) einen sagittalen Schnitt in die Haut machst.
4. Machen Sie mit dem spitzen Ende einer Schere nach Standardmuster einen kleinen Schnitt am Lambda und schneiden Sie entlang der Längsspalte.
5. Reflektieren Sie vorsichtig die paarigen Scheitel- und Hinterhauptknochen mit einem Paar flach gebogener Pearson-Rongeure.
   Anmerkung: Während dieses Verfahrens wird das Gehirn kontinuierlich in situ mit der zuvor vorbereiteten eiskalten sACSF-Aufschlämmung gebadet.
6. Isolieren Sie den Hirnstamm vom Vorderhirn und seiner knöchernen Umhüllung mit einer Rasierklinge (#11 gerade), um den Sulcus parieto-occipitalis und die kaudale Medulla zu durchtrennen.
7. Montieren Sie das isolierte ventrale Ende des Hirnstamms auf einen zuvor geschnittenen trapezförmigen Polystyrolblock. Verwenden Sie einen Docht aus Seidenpapier, um überschüssige Flüssigkeit um das präparierte Gewebe herum zu entfernen und eine gute Gewebehaftung bis zum Schnitt zu gewährleisten.
   Anmerkung: Der Polystyrolblock ist trapezförmig geschnitten, um sicherzustellen, dass das rostrale Ende des Mittelhirns in das Rückenmark passt und sich verjüngt.
8. Verwenden Sie Cyanacrylatkleber, um den Polystyrolblock mit dem befestigten rostralen Hirnstammende bis zum Schnittstadium zu fixieren.
9. Mit einer Vorschubgeschwindigkeit von 0,16 mm/s und einer Schwingungsamplitude von 3,00 mm werden 200 μm Querscheiben des MVN.
   Anmerkung: Die Lokalisation des MVN wird mit Hilfe des Paxinos- und Franklin-Maushirnatlas bestimmt. Das MVN (im Atlas als MVe geführt) liegt unmittelbar ventrolateral des 4. Ventrikels und ist direkt vor dem Ansatz des Kleinhirns (zwischen den Colliculi inferior und dem Obexex) am größten.
10. Verwenden Sie eine Pipette mit Kunststoffausschnitt, um die Scheiben mindestens 30 Minuten lang vor der Aufnahme auf eine Filterpapierscheibe zu übertragen, die in karbogeniertem ACSF bei 25 °C liegt.

>4. Instrumente

1. Verwenden Sie ein elektrophysiologisches Standard-Setup, um die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik durchzuführen.
2. Bereiten Sie Mikropipetten mit einem zweistufigen Protokoll (Heizschritt 1: 70; Heizschritt 2: 45) auf einem Mikropipettenabzieher vor (siehe Materialtabelle).
3. Wenn Mikropipetten in das Bad gestellt werden, sollten sie einen Endwiderstand von 3 bis 5 MΩ mit einer internen Lösung haben.
   Anmerkung: Die verwendeten Einstellungen können je nach Raumtemperatur variieren und sich recht häufig ändern.

>5. Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie

1. Um Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von einzelnen Neuronen im MVN zu erhalten, wird eine K+-basierte interne Lösung in der Aufzeichnungspipette verwendet.
2. Übertragen Sie eine einzelne Gewebescheibe aus der Inkubationskammer in die Aufnahmekammer und befestigen Sie sie mit einem Nylonfaden auf einem U-förmigen Gewicht. Die Aufnahmekammer wird kontinuierlich mit carbogeniertem ACSF bei 25 °C bei einer Durchflussrate von 3 mL/min perfundiert.
3. Nachdem Sie eine Mikropipette mit interner Lösung gefüllt haben, lokalisieren Sie das MVN mit einer Objektivlinse mit geringer Leistung (10x). Mit Hilfe eines Hochleistungsobjektivs (40x) können einzelne Neuronen innerhalb des MVN lokalisiert werden.
   Anmerkung: Die Zellqualität ist entscheidend, um qualitativ hochwertige Aufzeichnungen und die Haltbarkeit der Zelle zu gewährleisten, wenn versucht wird, die Ganzzellkonfiguration zu erreichen. Eine geeignete Zelle weist eine kugelförmige Form, eine reflektierende Zellmembran und einen unsichtbaren Zellkern auf. Eine ungeeignete Zelle hat einen großen sichtbaren Zellkern (eiähnlich) und ein geschwollenes/geschrumpftes Aussehen.
4. Bevor Sie mit der Pipette in das Gewebe eindringen, üben Sie einen kleinen Überdruck aus, um Schmutz von der Pipettenspitze wegzudrücken.
5. Bewegen Sie die Pipette mit dem Mikromanipulator in Richtung des ausgewählten Neurons, und es sollte sich ein kleines Grübchen auf der neuronalen Membran bilden.
   Lassen Sie den Überdruck ab und üben Sie einen kleinen Unterdruck aus.
6. Sobald eine 1-GΩ-Versiegelung erreicht ist, üben Sie durch den Sauganschluss einen sanften, kurzen und scharfen Unterdruck auf den Pipettenhalter aus, um die Membran zu zerreißen und eine Ganzzellenkonfiguration zu erzeugen.
7. Erstellen Sie Ganzzellen-Stromzangenaufnahmen mit Standardtechniken.

>6. Anwendung von sinusförmigem und stochastischem Rauschen auf einzelne Neuronen des medialen vestibulären Kerns

1. Wenden Sie das stochastische und sinusförmige Rauschen bei einem Amplitudenbereich von 3 bis 24 pA an, um die neuronale Schwelle und die Feuerrate zu bestimmen.
2. Bestimmen Sie die sensorische Schwelle, indem Sie niedrigere und höhere Reizintensitäten gruppieren und eine ANOVA durchführen, um eventuelle Unterschiede zu beobachten (wie in Abbildung 1 gezeigt).
3. Berechnen Sie die durchschnittliche Feuerungsrate über den Zeitraum von 10 s, in dem der depolarisierende Stromschritt für jeden einzelnen Strompegel injiziert wurde / wird (d. h. insgesamt 7 Episoden; Abbildung 2).
4. Verwenden Sie die Werte für die durchschnittliche Auslöserate, um eine Auslöserate im Vergleich zum aktuellen Diagramm zu generieren, und führen Sie eine lineare Regressionsanalyse durch, um den Gradienten der Linie der besten Anpassung zu bestimmen. Der Gradient der Best-Fit-Linie zeigt den neuronalen Gewinn an.

Ergebnisse

Abbildung 1: Objektive Bestimmung der 12 pA-Schwelle. Die Brennraten für weniger als 12 pA (3 und 6 pA) und mehr als 12 pA (18 und 24 pA) wurden gepoolt und gemittelt. Diese Durchschnittswerte wurden dann unter Verwendung einer ANOVA und einer statistischen Signifikanz zwischen Schein- und >12 pA und zwischen <12 pA und >12 pA analysiert. *p < 0,05.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
CaCl2	Scharlau	CA01951000	Wird für ACSF und sACSF verwendet
D-(+)-Glukose	Sigma	Nr. G8270	Wird für ACSF und sACSF verwendet
EGTA (EGTA)	Sigma	E0396-25G	Wird für intrazelluläre Lösungen auf K-Basis
HEPES	Sigma	H3375-25G	Wird für intrazelluläre Lösungen auf K-Basis
Kcl	Chem-Versorgung	PA054-500G	Wird für ACSF, sACSF und intrazelluläre Lösung verwendet
K-Gluconat	Sigma	Nr. P1847-100G	Wird für intrazelluläre Lösungen auf K-Basis
Mg-ATP	Sigma	Nr. A9187-500MG	Wird für intrazelluläre Lösungen auf K-Basis
MgCl	Chem-Versorgung	MA00360500	Wird für ACSF und sACSF verwendet
Na3-GTP	Sigma	G8877-100MG	Wird für intrazelluläre Lösungen auf K-Basis
NaCl	Chem-Versorgung	SO02270500	Verwendung für ACSF und intrazelluläre Lösung
NaH2PO4.2H 2O	Ajax	AJA471-500G	Wird für ACSF und sACSF verwendet
NaHCO3	Sigma	Nr. S5761-1KG	Wird für ACSF und sACSF verwendet
Saccharose	Chem-Versorgung	SA030-500G	Wird für sACSF verwendet
Isofluran	Henry Schein	1169567762	Zur Betäubung von Mäusen
Ausrüstung
Kapillaren aus Borosilikatglas	Warner-Instrumente	GC150T-7.5	1,5 mm Außendurchmesser, 1,16 mm Innendurchmesser, 7,5 cm Länge
Software zur Datenerfassung	Axograph		Wird für Elektrophysiologie und Analyse verwendet
Friedmen-Pearson Rongeurs	Weltpräzisionsinstrumente	Artikel-Nr.: 14089	Wird zum Sezieren verwendet
Abzieher für Mikropipetten	Narishige	PP-830	Wird für Mikropipetten verwendet
Multiclamp-Verstärker	Axon-Instrumente	700 Mrd.	Wird für die Elektrophysiologie verwendet
pH-Messgerät	Sper wissenschaftlich	860033	Wird für die interne Lösung verwendet
Standard-Modellschere	FST	Nr. 14028-10	Wird zum Sezieren verwendet
Sutter-Mikromanipulator	Sutter	MP-225/M	Wird für die Elektrophysiologie verwendet
Aufrechtes Mikroskop	Olymp	BX51WI	Wird für die Elektrophysiologie verwendet
Vibratom	Leica	VT1200	Wird zum Schneiden von Hirngewebe verwendet

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