Nachweis des Wasserstoffperoxidgehalts in kultivierten Neuronen durch Fluoreszenzbildgebung in lebenden Zellen

Zusammenfassung

Quelle: Terzi, A. et al., ROS Live Cell Imaging during Neuronal Development.J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Echtzeit-Detektion von Wasserstoffperoxid-Spiegeln in retinalen Ganglienzellen mit dem roGFP2-Orp1-Biosensor und Live-Cell-Imaging-Techniken. Es beschreibt die Schritte der Zellvorbereitung, der Fluoreszenzbildgebung und der Quantifizierung des Wasserstoffperoxidgehalts.

Protokoll

>1. In-vitro-Bildgebung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) von kultivierten Neuronen aus retinalen Ganglienzellen (RGC)

1. Am Tag der Bildgebung (in der Regel 6-24 Stunden nach der Zellplattierung) überprüfen Sie die retinalen Ganglienzellen unter einem Mikroskop, um das Wachstum der RGC-Axone zu validieren.
2. Für die Bildgebung lebender Zellen übertragen Sie Deckgläser aus der Kulturschale in eine Bildgebungskammer für lebende Zellen.
3. Richten Sie das Mikroskop für die Bildgebung ein. Verwenden Sie ein inverses Mikroskop, das mit einem DIC-Objektiv (Differential Interferenzkontrast), einem OG590-Langpass-Rotfilter und einer EM-CCD-Kamera ausgestattet ist.
4. Ersetzen Sie vor der Bildgebung das Zebrafisch-Zellkulturmedium mit Serum und Antibiotika (ZFCM)(+)) durch Zebrafisch-Zellkulturmedium ohne Serum und Antibiotika (ZFCM(-)).
5. Sobald die Zellen mit dem 10-fachen Objektiv positioniert sind, können Sie Bilder mit 60-facher Vergrößerung mit einem Ölimmersionsobjektiv mit hohem NA-Gehalt aufnehmen. Verwenden Sie eine zusätzliche 1,5-fache Vergrößerung.
6. Erfassen Sie zunächst DIC-Bilder. Anschließend wird roGFP2-Orp1 mit einem geeigneten Filtersatz abgebildet. Anregung von roGFP2-Orp1 mit 405/20 und 480/30 nm Anregungsfiltern nacheinander und Aufnahme von Bildern mit 535/30 nm Emissionsfilter, nachdem das Emissionslicht den dichroitischen Spiegel 505DCXR passiert hat.
7. Nachdem Sie die ersten Bilder aufgenommen haben, tauschen Sie Medien mit Medien aus, die unterschiedliche Behandlungslösungen enthalten. Das Medium sollte alle 30 Minuten der Bildgebung gewechselt werden, um Änderungen des pH-Werts und der Osmolarität zu vermeiden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
35-mm-Kulturschale	Sarstedt	Tel.: 83-3900
Deckglas	Corning	Nr. 2850-22
Einweg-Petrischalen (100 x 15 mm)	VWR	Artikel-Nr.: 25384-094
Fötales Rinderserum	ThermoFisher Scientific	26140087
Inverses Mikroskop	Nikon	TE2000
Laminin	ThermoFisher Scientific	Artikel-Nr.: 23017-015
Leibovitz's L-15 Medium mit Phenolrot	Gibco/Fisher Scientific	Tel.: 11-415-064
Leibovitz's L-15 Medium ohne Phenolrot	Gibco/Fisher Scientific	Tel.: 21-083-027
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
Phenolrot	Sigma Aldich	Nr. P0290
Poly-D-Lysin (PDL)	Sigma Aldich	Nr. 7280
Steritop 0,22 μm Filter	Millipore	S2GPT05RE
Calciumchlorid-Dihydrat	Fisher Scientific	Nr. C79-500
Traubenzucker	Sigma Aldrich	Nr. G7528
HEPES	Sigma Aldrich	Nr. H4034