Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der entsprechenden tierethischen Überprüfung überprüft und genehmigt.
1. Vorbereitung (optional: 1 Tag im Voraus vorbereiten)
- Bereiten Sie drei Arten von künstlicher Liquorlösung (ACSF) vor (Normal-, Saccharose- und Erholungslösung, jeweils 1 l; siehe Tabelle 1). Die Osmolalität der Lösungen auf 300 ± 10 mOsm einstellen und die ACSF-Saccharose auf einen Gefrierpunkt (0-4 °C) abkühlen.
Anmerkung: Die Verwendung einer natriumarmen Schneidlösung (ACSF-Saccharose) trägt dazu bei, die Lebensfähigkeit der Neuronen in den oberflächlichen Schichten akuter Schnitte zu erhalten.
- Bereiten Sie 0,75 ml Patch-Lösung vor, die ein rotes Fluorophor (z. B. Alexa-594) und einen grünen synthetischen Calciumindikator (z. B. Oregon Green BAPTA-1; siehe Tabelle 1) enthält. Biocytin (siehe Tabelle 1) ist in die Patch-Lösung aufzunehmen, wenn eine nachträgliche morphologische Identifizierung der aufgezeichneten Zellen erforderlich ist.
- Stellen Sie die Osmolalität der Lösung auf 280 ± 5 mOsm und den pH-Wert auf 7,35 ± 0,5 ein. Bewahren Sie die Lösung immer im Kühlschrank oder auf Eis auf.
Anmerkung: Die Wahl des Calciumindikators sollte auf seinem dynamischen Bereich und der Art der untersuchten Ca2+-Ereignisse basieren.
- Bereiten Sie mit einem Mikropipettenabzieher Patch-Pipetten aus Borosilikatglaskapillaren (siehe Materialtabelle) mit einer ≈ 2 μm Spitze (Pipettenwiderstand von 3-5 MΩ) und Stimulationspipetten aus Borosilikat-Thetaglaskapillaren (siehe Materialtabelle) mit einer 2-5 μm Spitze vor.
Anmerkung: Die Abziehereinstellungen zur Herstellung von Pipetten mit einem bestimmten Durchmesser und einer bestimmten Form werden durch den Abzieher-Filamenttyp und die Rampentestergebnisse für einen bestimmten Glastyp bestimmt.
2. Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen
- Setzen Sie eine Hippocampus-Scheibe in einem Bad unter dem Objektiv (Vergrößerung: 40x, numerische Apertur: 0,8) eines Laser-Scanning-Zwei-Photonen-Mikroskops in Position. Perfundieren Sie das Bad kontinuierlich mit sauerstoffhaltigem ACSF-Normal, das bei 30-32 °C mit einer Geschwindigkeit von 2,5-3 ml/min erhitzt wird.
- Verwenden Sie Infrarot-Differenzialinterferenzkontrast (IR-DIC) oder Dodt-SGC-Mikroskopie, um eine Zelle von Interesse anhand ihrer Größe, Form und Position zu lokalisieren.
Anmerkung: Abhängig von der Zielneuronenpopulation kann ein transgenes Mausmodell verwendet werden, um die interessierenden Zellen leicht zu lokalisieren. In diesem Fall kann dieser Schritt durch die Verwendung einer Leuchtstoffröhre ersetzt werden.
- Füllen Sie eine Stimulationspipette mit einer ACSF-Normal-Lösung, die das rote Fluorophor enthält (z. B. Alexa-594).
- Setzen Sie die Stimulationspipette (verbunden mit einem elektrischen Stimulationsgerät) so auf die Schnittscheibe, dass sich die Spitze in derselben Region wie die gewünschte Zelle befindet.
- Nachdem Sie die Patch-Pipette mit Patch-Lösung gefüllt und an einem Kopftisch befestigt haben, setzen Sie sie so über die Scheibe, dass sich ihre Spitze direkt über der interessierenden Zelle befindet.
- Setzen Sie eine Spritze in einen Dreiwege-Absperrhahn ein und verbinden Sie sie durch das Kunststoffrohr mit der Patch-Pipette. Injizieren Sie mit der Spritze einen konstanten Überdruck (≈ 0,1 ml) in die Patch-Pipette. Halten Sie den Absperrhahn in einer "geschlossenen" Position.
- Aktivieren Sie das Softwaremodul für die Verstärkersteuerung und wechseln Sie in den Voltage-Clamp-Modus, indem Sie auf die Schaltfläche "VC" klicken. Öffnen Sie die elektrophysiologische Datenerfassungssoftware (z. B. clampex) für die Erfassung elektrophysiologischer Signale und klicken Sie auf das Symbol "Membrantest", um kontinuierlich einen Rechteckspannungsimpuls (5 mV, 10 ms) auszusenden, der zur Überwachung von Änderungen des Pipettenwiderstands erforderlich ist.
- Senken Sie die Patch-Pipette ab, bis sie sich ganz oben auf der Zielzelle befindet. Bei Berührung mit der Zellmembran den Druck verringern, indem der Absperrhahn in die Stellung "offen" gedreht wird.
Anmerkung: Ein Kontakt mit der Zellmembran wird erkannt, wenn ein geringer Anstieg des Pipettenwiderstands (≈ 0,2 MΩ) und eine kleine Vertiefung auf der Zelle durch Überdruck verursacht wird.
- Üben Sie mit einer leeren Spritze, die in den Absperrhahn eingesetzt wird, einen leichten Unterdruck auf die Patch-Pipette aus, bis der von der Software bereitgestellte Pipettenwiderstand 1 GΩ erreicht. Klemmen Sie die Zelle im Fenster "Membrantest" der Datenerfassungssoftware bei -60 mV ein.
- Üben Sie weiterhin Unterdruck aus, bis die Zelle geöffnet ist und die Ganzzellenkonfiguration erreicht ist. Die Detektion dieses Zellzustands basiert auf der plötzlichen Änderung des Pipettenwiderstands (von 1 GΩ auf 70-500 MΩ je nach Interneurontyp) und dem Auftreten großer kapazitiver Transienten im Fenster "Membrantest".
3. Zwei-Photonen-Calcium (Ca2+)Bildgebung
- Wenn Sie an den exzitatorischen postsynaptischen Reaktionen interessiert sind, fügen Sie dem ACSF-Bad den GABAA-Rezeptorblocker Gabazin (10 μM) und den GABAB-Rezeptorblocker CGP55845 (2 μM) hinzu.
- Stellen Sie im Softwaremodul für die Verstärkersteuerung die Patch-Konfiguration auf Stromklemme ein, indem Sie auf die Schaltfläche "CC" klicken, und zeichnen Sie das Zündmuster der Zelle als Reaktion auf somatische Injektionen von depolarisierendem Strom (0,8-1,0 nA, 1 s) auf. Warten Sie mindestens 30 Minuten, bis die Zelle mit den in der Patch-Lösung vorhandenen Indikatoren gefüllt ist.
Anmerkung: Das Feuermuster und die aktiven Eigenschaften der Zelle können verwendet werden, um ihren Subtyp zu identifizieren, z. B. schnell spicende Zellen. Es ist wichtig, dass sich die Indikatorkonzentration durch Diffusion stabilisiert, bevor mit der Aufzeichnung von Calciumtransienten (CaTs) begonnen wird (siehe Tabelle 2 zur Fehlerbehebung).
- AP-evozierte CaTs
- Beginnen Sie mit der Bildaufnahmesoftware mit der Aufnahme von Bildern. Lokalisieren Sie einen Dendriten von Interesse anhand des roten Fluoreszenzsignals. Um eine sichtbare Reaktion zu gewährleisten, wählen Sie zunächst einen proximalen Dendriten (≤ 50 μm), da die Effizienz der AP-Backpropagation mit zunehmender Entfernung in GABAergen Interneuronen signifikant abnehmen kann.
- Vergrößern Sie mit dem "Rechteck-Werkzeug" in der Bildaufnahmesoftware den Zielbereich und wechseln Sie in den "xt"-Modus (Zeilenscan). Positionieren Sie den Scan über dem gewünschten dendritischen Ast. Stellen Sie den Zwei-Photonen-Laser mit den Laserintensitätsreglern in der Erfassungssoftware auf eine minimale Leistung ein, bei der die grüne Fluoreszenz an der Grundlinie nur leicht sichtbar ist, um Phototoxizität zu vermeiden.
- Erstellen Sie in der elektrophysiologischen Datenerfassungssoftware "Protokoll" und in der Bilderfassungssoftware einen Aufnahmeversuch mit der gewünschten Dauer, der eine somatische Strominjektion in der gewünschten Amplitude enthält.
- Klicken Sie mit der Bildaufnahmesoftware auf die Schaltfläche "Aufnahme starten" und erfassen Sie die Fluoreszenz kontinuierlich für 1-2 s. Wiederholen Sie die Bildaufnahme 3-10 Mal. Warten Sie mindestens 30 s zwischen den einzelnen Scans, um Lichtschäden zu vermeiden. Wenn du Linescan an mehreren Punkten entlang eines Dendriten erhältst, nimm sie in zufälliger Reihenfolge, um Ordnungseffekte zu vermeiden.
- Synaptisch evozierte CaTs
- Lokalisieren Sie einen Dendriten von Interesse anhand des roten Fluoreszenzsignals.
- Setzen Sie die Stimulationspipette auf die Oberfläche der Scheibe über dem gewünschten Dendriten. Senken Sie die Stimulationspipette langsam in Position ab und minimieren Sie die Bewegungen, um eine Störung der Ganzzellkonfiguration zu vermeiden. Positionieren Sie die Pipette in einem Abstand von 10-15 μm zum Dendriten.
- Um die Position der synaptischen Mikrodomänen in aspinnen Dendriten zu visualisieren, wechseln Sie in der Bildaufnahmesoftware in den "xt"-Modus (Linescan) und positionieren Sie die Linie entlang des gewünschten dendritischen Zweigs.
- Erstellen Sie im Fenster "Protokoll" (der Elektrophysiologie-Datenerfassungssoftware) und der Bilderfassungssoftware einen Aufnahmeversuch, der die Stimulationseinheit nach dem Versuchsstart auslöst.
- Klicken Sie mit der Erfassungssoftware auf die Schaltfläche "Aufnahme starten", um 1-2 s lang ununterbrochen entlang des Dendriten zu scannen. Wiederholen Sie die Aufnahme 3-5 Mal und warten Sie 30 s zwischen den Scans, um Lichtschäden zu vermeiden.
Anmerkung: Die Länge des Scans kann je nach Kinetik des evozierten Ereignisses angepasst werden, sollte jedoch minimiert werden, um Lichtschäden zu vermeiden (siehe Tabelle 2 zur Fehlerbehebung).
- Wiederholen Sie Schritt 3.4.5 unter verschiedenen Bedingungen (z. B. unterschiedliche Intensität/Dauer der Stimulation, Einführung eines pharmakologischen Blockers usw.), je nachdem, welche Frage bearbeitet wird.
- Stoppen Sie die Akquisition, wenn die Zelle Anzeichen einer Verschlechterung des Gesundheitszustands zeigt: Depolarisation unter -45 mV, Anstieg des Ca2+-Ausgangswerts, morphologische Verschlechterung der Dendriten (z. B. Bläschen, Fragmentierung; siehe Tabelle 2 zur Fehlerbehebung).
- Um vorläufige Informationen über die Morphologie der Zelle zu erhalten und die Position der Stimulationspipette zu protokollieren, erfassen Sie einen Z-Stapel der Zelle im roten Kanal. Legen Sie mit der Erfassungssoftware im "xyz"-Modus die obere und untere Stapelgrenze fest, um die gesamte Zelle mit allen enthaltenen Prozessen abzubilden. Stellen Sie die Schrittweite auf 1 μm ein und starten Sie die Stack-Erfassung mit der Schaltfläche "Aufnahme starten".
- Wenn die Z-Stapel-Erfassung abgeschlossen ist, verwenden Sie die Option "Maximale Projektion" in der Software, um alle Fokuspläne des Stapels zu überlagern und die Qualität der Aufnahme zu überprüfen. Ziehen Sie dann die Patch-Pipette langsam aus der Scheibe zurück.
- Um die Scheibe für die nachträgliche morphologische Identifizierung zu fixieren, nehmen Sie die Scheibe schnell mit einem flachen Pinsel aus dem Bad und legen Sie sie zwischen zwei Filterpapiere in eine mit ACSF gefüllte Petrischale. Ersetzen Sie die ACSF durch eine 4%ige Paraformaldehyd (PFA)-Lösung und lassen Sie das Gericht über Nacht in einem 4 °C warmen Raum oder Kühlschrank stehen.
Tabelle 1: Lösungsrezepte. Verbindungen und Konzentrationen für Lösungen, die während des Protokolls verwendet werden.
kg
kg
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kg
kg
kg
kg
kg
| Lösung | Bestandteil | Konzentration (mM) |
| ACSF-Normal | NaCl | Nr. 124 |
| Kcl | 2,5 |
| NaH2PO4 | 1,25 |
| MgSO4 | arabische Ziffer |
| NaHCO3 | 26 |
| Traubenzucker | 10 |
| CaCl2 | arabische Ziffer |
| ACSF-Wiederherstellung | NaCl | Nr. 124 |
| Kcl | 2,5 |
| NaH2PO4 | 1,25 |
| MgSO4 | 3 |
| NaHCO3 | 26 |
| Traubenzucker | 10 |
| CaCl2 | 1 |
| ACSF-Saccharose | Kcl | arabische Ziffer |
| NaH2PO4 | 1,25 |
| MgSO4 | 7 |
| NaHCO3 | 26 |
| Traubenzucker | 10 |
| Saccharose | Nr. 219 |
| CaCl2 | 1 |
| K+-basierte Patch-Lösung | K+-Gluconat | Nr. 130 |
| HEPES | 10 |
| MgCl2 | arabische Ziffer |
| Phosphokreatin Di(tris)salz | 10 |
| ATP-Tris | arabische Ziffer |
| GTP-Tris | 0,2 |
| Biocytin | 72 |
| Alexa-594 | 0,02 |
| Oregon Grün-BAPTA-1 | 0,2 |
Tabelle 2: Tabelle zur Fehlerbehebung. Lösungen für häufige Probleme, die während eines Ca2+-Bildgebungsexperiments auftreten können.
heraus
| Problem | Lösung |
| Gesundes Neuron kann nicht gepatcht werden | Achten Sie auf Anzeichen dafür, dass die Scheiben ungesund sind: geschrumpfte oder geschwollene Zellen, sichtbare Zellkerne usw. Wenn ja, verwerfen Sie die Scheiben. Überprüfen Sie auch den Widerstand der Patch-Pipette und die Osmolalität der Patch-Lösung. Ersetzen Sie sie, wenn die Werte nicht im entsprechenden Bereich liegen. |
| Das Fluoreszenzsignal von Dendriten ist gering | Warten Sie länger, bis die Zelle gefüllt ist. Wenn ein Hindernis verhindert, dass die Patch-Lösung in die Zelle diffundiert, versuchen Sie, einen kleinen Unterdruck in der Patch-Pipette auszuüben. |
| Elektrische Stimulation ruft keine Ca2+-Reaktion hervor | Überprüfen Sie, ob in der elektrophysiologischen Aufzeichnung ein Artefakt vorhanden ist. Falls nicht vorhanden, prüfen Sie, ob eine Fehlfunktion des Kurzschluss-/Stimulationsgeräts vorliegt. Falls vorhanden, erhöhen Sie die Stimulationsintensität oder bewegen Sie die Stimulationspipette näher an den Dendriten. Es ist zu beachten, dass der Abstand zwischen der Stimulationselektrode und dem Dendriten 8 μm nicht überschreiten sollte, um eine direkte Depolarisation der Dendriten bei der Untersuchung synaptischer Reaktionen zu verhindern. |
| Das evozierte Ca2+-Signal ist zu hoch/sättigt die Ca2+-Anzeige | Reduzieren Sie die Laserleistung. Wenn das Problem in mehreren Zellen weiterhin besteht, verwenden Sie einen anderen Ca2+-Indikator mit einer niedrigeren Ca2+-Affinität. |
| Das Ca2+-Signal zu Studienbeginn nimmt während des Experiments allmählich zu | Warten Sie zwischen den einzelnen Scans einen längeren Zeitraum. Wenn die Basislinie immer noch ansteigt, beenden Sie die Akquisition. Es deutet darauf hin, dass sich die Gesundheit der Zelle wahrscheinlich verschlechtert. |
| Die Amplitude des Ca2+-Signals nimmt während der Scans ab | Reduzieren Sie die Laserleistung oder zoomen Sie heraus (falls zutreffend). |
| Dendrit fragmentiert ("blebbing") nach dem Scannen | Reduzieren Sie die Laserleistung oder zoomen Sie heraus. Wenn das Blebbing auf den anvisierten Dendriten beschränkt ist, wählen Sie einen anderen Dendriten und reduzieren Sie die Laserleistung/zoomen Sie heraus. Wenn mehrere Dendriten blasen, stoppen Sie die Erfassung. |
| Fluoreszenzsignale "driften" nach Sweeps aus der Scanlinie | Reduzieren Sie die Bewegung in der Schicht, indem Sie die Geschwindigkeit der ACSF-Perfusion verringern. Vergewissern Sie sich vor dem Patchen, dass das Slice mit einem Netz fest fixiert ist. |