Alle Verfahren mit Tiermodellen wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE Veterinärprüfungsausschuss überprüft.
>1. Zusammenbau der Aufnahme-Injektionspipette
- Ziehen Sie mit einem Pipettenabzieher an einer ca. 7 cm langen Glaskapillare (1 mm Außendurchmesser).
- Brechen Sie die Kapillarspitze und überprüfen Sie die Öffnung unter einem Lichtmikroskop. Vergewissern Sie sich, dass der Innendurchmesser zwischen 30 μm und 40 μm liegt.
- Führen Sie einen 7 cm langen Silberdraht in die Glaskapillare ein, wobei ca. 1 cm aus dem nicht konischen Ende der Glaspipette herausragt.
- Biege das überschüssige Filament orthogonal zur Glaskapillare.
- Tragen Sie ein Tröpfchen flexiblen Kunststoffkleber auf den Schaft einer 30 G Injektionsnadel auf.
- Führen Sie eine 30 G Injektionsnadel in die Glaspipette ein, wie in Abbildung 1 dargestellt
.
- Fügen Sie eine zweite Klebeschicht hinzu, um eine ordnungsgemäße Abdichtung der Verbindung zwischen der Glaspipette und der Injektionsnadel zu gewährleisten.
- Lassen Sie die Pipette mit der Spitze nach oben etwa 12 Stunden trocknen, um eine ordnungsgemäße Aushärtung des Klebers zu gewährleisten. Das fertige Ergebnis ist in Abbildung 2 dargestellt.
HINWEIS: Dieses Verfahren wird in akuten Experimenten durchgeführt, und eine Sterilisation der Pipettenspitze ist nicht erforderlich.
>2. Vorbereitung von Tieren
- Lege die Ratte in eine Narkosebox.
- Induzieren Sie eine Anästhesie mit 4% Isofluran für 5 bis 10 Minuten.
- Legen Sie das Tier mit einem Heizkissen und einer rektalen Sonde auf einen stereotaktischen Tisch, um eine Körpertemperatur von 37 °C aufrechtzuerhalten. Verwenden Sie einen Nasenkonus mit 2 % Isofluran, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten. Befestigen Sie den Rattenkopf mit Ohrstangen und einem Zahnhalter.
- Tragen Sie Augensalbe oder Augentropfen, einschließlich 1% Atropin-Tropfen, auf, um die Pupillenerweiterung zu unterstützen. Um Trockenheit zu vermeiden, tragen Sie etwa alle 30 Minuten Gleittropfen auf.
- Rasieren Sie den Kopf und reinigen Sie ihn mit 10% Povidon-Jod.
- Für die Lokalanästhesie injizieren Sie 0,5 ml 2% Lidocain an 2-3 Stellen unter die Kopfhaut, indem Sie die Haut anheben und die Nadelspitze einführen.
- Bestätigen Sie ein angemessenes Maß an Anästhesie, indem Sie eine Zehenkneifung durchführen und den Bewegungsmangel beobachten. Darüber hinaus muss die Herzfrequenz überwacht werden, um sicherzustellen, dass sie sich innerhalb der normalen Werte (300 bis 400 Schläge/min) befindet.
- Schneiden Sie die Kopfhaut in einer geraden Linie entlang des Medians mit einer Skalpellklinge #10 ein, um sowohl die koronale als auch die sagittale Naht freizulegen.
- Legen Sie die Lambda- und Bregma-Punkte frei, indem Sie das Gewebe, das den Schädel bedeckt, mit einem chirurgischen Spatel beiseite schieben.
- Richten Sie den Schädel so aus, dass sich die Bregma- und Lambda-Positionen auf derselben Ebene befinden.
- Um den Referenzpunkt einzustellen, verwenden Sie ein stereotaktisches Gerät mit einem montierten Glasrohr, um es direkt über Bregma zu platzieren. Dies wird die "Null" für die anteroposterioren und medial-lateralen Messkoordinaten sein.
- Legen Sie den Point of Interest fest, indem Sie die stereotaktische Halterung auf die erforderlichen Koordinaten bewegen, notieren Sie sich die stereotaktischen Koordinaten und zeichnen Sie ein Quadrat um den Zielbereich, das die Stelle markiert, an der die Kraniotomie durchgeführt wird.
- Verwenden Sie einen chirurgischen Bohrer mit einem sterilisierten Bohrer entlang des markierten Quadrats langsam und ohne Druck, um das Knochenmaterial zu entfernen. Achten Sie darauf, nicht zu lange in denselben Bereich zu bohren, da dies Hitze erzeugt und Läsionen im Kortex verursacht.
- Wenn der Knochen, der die Kraniotomie begrenzt, ausreichend dünn geworden ist, entfernen Sie den Schädelabschnitt vorsichtig mit einer Pinzette, um die Rinde freizulegen.
- Spülen Sie die exponierte Hirnrinde häufig mit künstlicher Hirnmarksflüssigkeit, um eine Austrocknung des Gewebes zu verhindern.
Anmerkung: Die Entfernung von Dura mater ist bei der Ratte unnötig, da die Spitze der Injektionsrode stabil genug ist, um einzudringen.
>3. Befüllen und Montieren des Einspritzsystems
- Füllen Sie die 5-10 μl Mikrospritze durch Aspiration mit Mineralöl.
- Füllen Sie die Injektionsnadel mit der fixierten Glaspipette mit einer Lösung aus 0,5 % Chicago Sky Blue (CSB) und 300 μM γ-Aminobuttersäure (GABA) oder einer Lösung von 2 % Lidocain mit 0,5 % CSB 9. Verdünnen Sie alle Lösungen mit Kochsalzlösung.
- Im Falle einer reichlich vorhandenen Substanz füllen Sie sie mit einer normalen Spritze ab und wenden Sie die üblichen vorbeugenden Techniken an, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
- Bei teureren Substanzen kann die Injektionsrode mit Mineralöl gefüllt werden, und das chemische Mittel kann dann durch Aspiration eingebracht werden. Der Dichteunterschied zwischen Mineralöl und Wasser ist relativ groß, so dass diese Substanz ein guter Kandidat für die Injektion von wässrigen Lösungen ist.
Anmerkung: Es kann ein Farbstoff hinzugefügt werden, um die Trennung zwischen beiden Flüssigkeiten zu bestätigen.
- Um die Injektionspipette zu füllen, aspirieren Sie eine 1-ml-Spritze mit der Lösung und injizieren Sie sie langsam in die Pipette.
- Achten Sie sorgfältig auf Lecks in den in Abbildung 1 gezeigten Bereichen, indem Sie diese Bereiche sauber tupfen und Leckagen beobachten, indem Sie die Lösung langsam mit der Spritze injizieren.
- Entfernen Sie die 1-ml-Spritze. Halten Sie dabei leichten Druck auf den Kolben, damit das Vakuum die Lösung nicht aus der Injektionspipette entfernt.
- Aspirieren Sie die Mikrospritze mit Mineralöl und befestigen Sie sie fest an der gefüllten Injektionspipette. Wischen Sie dann vorsichtig überschüssige Lösung von der zusammengebauten Injektionsrode mit Gaze ab.
- Injizieren Sie ein sehr kleines Volumen, so dass sich an der Spitze der Glaspipette ein kleiner Tropfen bildet, um sicherzustellen, dass die Spitze nicht verstopft ist.
- Montieren Sie die Injektionsrode am Mikropumpensystem und stellen Sie sicher, dass sie gut befestigt ist.
- Positionieren Sie die Injektionsrodenspitze vorsichtig an den Zielkoordinaten und senken Sie die Spitze auf die Oberfläche des Kortex.
- Die Injektionsrode wird mit dem stereotaktischen Apparat unter Verwendung der entsprechenden anatomischen Koordinaten langsam auf die Zielstruktur (Colliculus superior) abgesenkt.
- Decken Sie die freiliegende Rinde mit warmem Agar ab, um eine Austrocknung des Gewebes zu verhindern.
>4. Injektion und reversible Inaktivierung
- Stellen Sie die Mikroinjektionspumpe so ein, dass sie 400 bis 800 nl bei 40 nl/min einspritzt, und drücken Sie Run, um die Injektion zu starten. Beachten Sie, dass die Spike-Rate während der Injektion abnimmt.
HINWEIS: Im Versuchsaufbau erholte sich die neuronale Aktivität innerhalb einer Stunde nach dem Ende der GABA-Verabreichung. Jedes kalibrierte mechanische Gerät kann verwendet werden, um Druck auf die Mikroinjektionsspritze auszuüben und die Injektion durchzuführen.
- Nachdem Sie die elektrophysiologischen Daten erfasst haben, euthanasieren Sie mit einer von der örtlichen Tierethik-Gemeinschaft zugelassenen Methode.
