Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.
>1. Vorbereitung von Lösungen
- Bereiten Sie 500 ml künstliche Standardflüssigkeit (ACSF) vor, die die in unserer veröffentlichten Arbeit beschriebenen Komponenten enthält, die in Tabelle 1 aufgeführt sind.
- Verwenden Sie saubere Glasbecher mit entionisiertem Wasser, um eine frische ACSF-Lösung zuzubereiten. Reinigen Sie die Spatel mit entionisiertem Wasser und trocknen Sie sie vor der Verwendung, um Natriumchlorid (NaCl), Kaliumchlorid (KCl), Dihydrogennatriumphosphat (NaH2PO4), Natriumbicarbonat (NaHCO3), Magnesiumsulfat (MgSO4) und D-Glucose hinzuzufügen, und fügen Sie das Calciumchlorid (CaCl2) hinzu, nachdem Sie die Lösung mit 95 % O2 / 5 % CO2 gefüllt habenMischung für ~20 min (wie in Tabelle 1 beschrieben) auf 500 mL deionisiertes Wasser auffüllen. Rühren, bis es sich vollständig aufgelöst hat.
- Stellen Sie sicher, dass der ACSF vollständig klar und ohne Niederschlag ist. Stellen Sie dann den pH-Wert auf 7,2-7,4 ein. Blase mit einem Gasgemisch aus 95%O2 und 5% CO2 für ~20 min.
- Bereiten Sie 250 ml Schnittschneidlösung vor, die die in Tabelle 2 beschriebenen Chemikalien enthält.
- KCl, Magnesiumchlorid (MgCl2), NaH2PO4, NaHCO3, Cholin·Cl und D-Glucose werden zugegeben und das Calciumchlorid (CaCl2) zuletzt wie in Abschnitt 1.1.1 angegeben zu 250 ml entionisiertem Wasser gegeben und wie in Abschnitt 1.1.1 und 1.1.2 beschrieben gelöst.
- Nach dem Blasen mit 95 % O2/5 % CO2 die Lösung für 15-20 min in einen Gefrierschrank stellen, so dass die Schneidlösung eiskalt und teilweise gefroren wird.
Anmerkung: Wir verwenden diese Schneidlösung, wenn wir Scheiben von 1-2 Monate alten Mäusen herstellen; Die Formel kann für Mäuse, die älter als 2 Monate sind, abweichen.
- Bereiten Sie eine Lipopolysaccharid-Lösung (LPS) vor, indem Sie sie in steriler, endotoxinfreier isotonischer Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) auflösen. LPS wird intraperitoneal (0,5 mg/kg) verabreicht und beginnt 2 Stunden später mit der Aufzeichnung.
>2. Vorbereitung der präfrontalen Kortexscheibe
- Nehmen Sie die Schneidlösung aus dem Gefrierschrank und homogenisieren Sie sie, um einen Matsch zu erhalten. Die Lösung auf Eis geben und konstant mit 95 % O2/5 % CO2 aufblasen lassen.
- Enthaupten Sie eine Maus mit einer großen, scharfen Schere wie beschrieben und legen Sie den Kopf sofort in ein Becherglas, das mit eiskalter (0-4°C) Schneidlösung gefüllt ist.
- Schneide die Oberseite des Schädels entlang der Mittellinie in kaudaler bis nasaler Richtung mit einer feinen Schere ab und entferne die seitlichen Schädelanteile. Entfernen Sie das Gehirn mit einem feinen Spatel und geben Sie es in eiskalte Schneidlösung.
Anmerkung: Die Schritte 2.2-2.3 müssen schnell durchgeführt werden (idealerweise < 1 min).
- Legen Sie das Gehirn auf den Deckel einer 9 cm großen Petrischale, die mit Eis gefüllt ist. Spülen Sie das Gehirn mit eiskalter Schneidlösung ab. Schneide das Kleinhirn und den Riechkolben mit einer Rasierklinge ab.
- Tragen Sie Cyanacrylatkleber auf den Probenhalter eines Vibratoms auf. Legen Sie den Gehirnblock vorsichtig mit der rostralen Seite nach oben auf den Leimtropfen und tauchen Sie ihn sofort in eiskalte Schneidlösung.
- Stellen Sie den Klingenhalter des Vibratoms in einem Winkel von 15° in Bezug auf die horizontale Ebene ein und bereiten Sie 350 μm koronale Hirnschnitte vor (Klingenvibrationsfrequenz = 85 Hz, Geschwindigkeit = 0,1 mm/s).
- Die Scheiben mit einer Pipette in die mit ACSF gefüllte Auffangkammer überführen und 1 h (bei RT) mit konstanter Blasenbildung von 95 % O2/5 % CO2 inkubieren.
>3. Ganzzell-Patch-Aufzeichnung
- Stellen Sie Borosilikat-Mikropipetten aus Glas für die Verwendung als Aufzeichnungselektroden oder Puff-Mikropipetten gemäß den spezifischen Richtlinien in der Bedienungsanleitung des Abziehers her. Für die Aufzeichnung von Elektroden liegen die Spitzenwiderstände im Bereich von 4-6 MΩ, während Puff-Mikropipetten Spitzendurchmesser im Bereich von 2-5 μm haben.
- Fügen Sie ACSF einen Na+-Kanalblocker (Tetrodotoxin (TTX), 1 μM) hinzu, um den schnellen Na+-Kanal und damit die Aktionspotentiale zu blockieren, und halten Sie eine konstante Flussrate dieser Lösung von 2-3 mL/min in der Aufnahmekammer aufrecht, indem Sie peristaltisch in die Kammer pumpen und aus ihr heraus aspirieren. Blasen Sie den ACSF ständig mit 95 % O2/5 % CO2 aus, um die Lebensfähigkeit der Scheiben zu gewährleisten.
- Übertragen Sie ein Hirnschnitt mit einer modifizierten Pasteur-Pipette, deren feine Spitze an die Scheibengröße angepasst wurde, in die Aufnahmekammer. Decken Sie die Scheibe mit einem Platin-Scheibenanker mit parallelen Nylonfäden im Abstand von ≥2 mm ab, um die Scheibe auf der Plattform zu halten.
- Füllen Sie die Aufzeichnungsmikropipette mit interner Lösung (Tabelle 3) und füllen Sie die Puff-Mikropipetten mit Gamma-Aminobuttersäure (GABA) bei 10 μM, 50 μM und 100 μM (gelöst in ACSF) oder ACSF als Vehikelkontrolle.
- Um eine Verstopfung durch Schmutz zu vermeiden, üben Sie mit einer 1-ml-Spritze einen leichten Überdruck aus, bevor Sie die Aufzeichnungselektrode in den ACSF eintauchen. Positionieren Sie die Aufzeichnungselektrode und die Puff-Mikropipette mit einem Mikromanipulator unter einem Mikroskop (4x Objektiv) so, dass die Spitzen in der Mitte des Videobildes auf dem Monitor erscheinen (Abbildung 1A).
- Stellen Sie den Mikroskopfokus (40-fach-Objektiv) ein, während Sie die Puff-Mikropipette allmählich absenken und in einem Winkel von 45° über dem Aufnahmeneuron platzieren. Halten Sie den Abstand zwischen der Spitze der Puff-Mikropipette und dem aufgezeichneten Neuron zwischen 20 und 40 μm (Abbildung 1B). Nähern Sie sich langsam und vorsichtig mit der Aufzeichnungselektrode dem Neuron und lassen Sie dann den Überdruck los. Üben Sie einen schwachen und kurzen Sog durch den Schlauch aus, der mit dem Elektrodenhalter verbunden ist, um eine Giga-Ohm-Dichtung zu erzeugen.
- Halten Sie die Spannung bei 0 mV. Nach der Bildung der Giga-Ohm-Dichtung wird die schnelle und langsame Kapazität manuell oder automatisch kompensiert. Üben Sie dann einen kurzen und starken Sog durch den oben erwähnten Schlauch aus, um in den Ganzzellenmodus zu gelangen.
- Nehmen Sie eIPSC im Voltage-Clamp-Modus auf. Üben Sie einen niedrigen Gasdruck (Stickstoff, 4 - 6 psi) auf die Puff-Mikropipette aus, indem Sie einen Picospritzer verwenden, der von einem Master 8-Spannungsstufengenerator gesteuert wird, um einzelne oder gepaarte GABA-Puffs zu liefern (Abbildung 2).
Tabelle 1. ACSF wird aufgezeichnet.
kg
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| Substanz | g/mol | Konzentration (mM) | Gewicht (g/L) |
| NaCl | 58.443 | Nr. 119 | 6,9547 |
| Kcl | 74.551 | 2,5 | 0,1864 |
| NaH2PO4 | 137,99 | 1 | 0,1380 |
| NaHCO3 | 84.007 | 26,2 | 2.2010 |
| MgSO4 | 120.366 | 1.3 | 0,1565 |
| D-Glukose | 198,17 | 11 | Nr. 2.1799 |
| CaCl2 | 110,98 | 2,5 | 0,2775 |
Tabelle 2. Lösung zum Schneiden von Scheiben.
kg
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kg
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kg
| Substanz | g/mol | Konzentration (mM) | Gewicht (g/L) |
| Kcl | 74.551 | 2,5 | 0,1864 |
| MgCl2 | 95.211 | 7 | 0,6665 |
| NaH2PO4 | 137,99 | 1,25 | 0,1725 |
| NaHCO3 | 84.007 | 25 | 2,1002 |
| Cholin·Cl | 139,63 | Nr. 115 | 16,0575 |
| D-Glukose | 198,17 | 7 | 1,3872 |
| CaCl2 | 110,98 | 0,5 | 0,0555 |
Tabelle 3. Interne Lösung für Ganzzell-Patch-Aufzeichnungen.
kg
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kg
| Substanz | g/mol | Konzentration (mM) | Gewicht (g/L) |
| Cs Gluconat | Artikel-Nr.: 328.052 | 100 | 32,8052 |
| CsCl | 168,36 | 5 | 0,8418 |
| HEPES | Artikel-Nr.: 238.301 | 10 | 2,3830 |
| MgCl2 | 95.211 | arabische Ziffer | 0,1904 |
| CaCl2 | 110,98 | 1 | 0,1110 |
| BAPTA | Artikel-Nr.: 476.433 | 11 | 5.2408 |
| Na2ATP | 551,1 | 4 | 2.2044 |
| Na2GTP | 523,2 | 0,4 | 0,2093 |
